基于氧化香菇多糖金纳米簇复合物的电化学发光在腐胺检测中的应用

刘星洁,侯娟,田数,贾学伟,李天笑,许春平

1.河南省高校电力节能减排工程技术研究中心 河南 郑州 450000;2.郑州电力高等专科学校,河南 郑州 450000;3.内蒙古昆明卷烟有限责任公司,内蒙古 呼和浩特 010020;4.郑州轻工业大学 烟草科学与工程学院,河南 郑州 450001

0 引言

近年来,食品安全问题频频发生,引起了人们对食品安全的高度重视。在食物加工和储存过程中易生成生物胺,主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、组胺等,会对生物胺敏感人群的健康造成危害[1]。其中,腐胺广泛存在于生物体组织中,但若通过食物摄取过量的外源性腐胺,则会对机体产生各种不良反应[2]。另外,食物腐败或变质后通常含有高质量浓度的腐胺,因此腐胺质量浓度可作为食品新鲜度的一个重要评价指标。目前,腐胺的检测方法主要包括高效液相色谱法、光谱法、质谱法、电泳法等,但这些方法存在耗时长、操作复杂、成本较高等问题[3]。生物胺在可见光、紫外光和常见荧光区域没有足够的特征吸收现象,通常需要进行衍生化处理,如现行国标为高效液相色谱法,采用丹磺酰氯法进行柱前衍生化,但存在灵敏度低、耗时长、不易批量处理等缺点。因此,建立简单、快速的腐胺检测方法对食品质量监测具有重要意义。

电化学发光(ECL)是指通过对发光体外加电位触发的电化学发光现象。ECL传感器具有灵敏度高、动态范围宽、噪音低、易调节、操作简单等优点。最初用于ECL传感器的通常是有机金属配合物,2002年,Z.Ding等[4]首次使用硅纳米晶体作为发光体。后来,各种ECL活性半导体纳米晶体如雨后春笋般涌现,如Ⅱ-Ⅵ化合物(CdS、CdSe等)和卤化物钙钛矿[5-6]。近年来,金属纳米团簇(MeNCs)[7],尤其是具有良好的生物相容性、精度、光学稳定性和电化学性能的金纳米簇(AuNCs),具有广阔的ECL应用前景。然而,AuNCs合成过程和分散过程中常用的含硫化合物(硫醇、2-苯基乙硫醇、2-巯基-5-正丙基嘧啶等)会带来一定的生物安全隐患[8-10],且其特殊结构(如金属MOF结构)在合成和分离纯化成本方面也面临较大挑战[11-12]。总之,AuNCs的合成和分散需考虑回收技术、合成成本和潜在环境污染或生物安全性。

前期研究[13]发现,利用未改性香菇多糖在高功率微波辅助下合成的AuNCs平均粒径约为3.3 nm,且由于未改性香菇多糖还原性较弱、分散稳定效果较差,合成的AuNCs不能稳定存在。鉴于此,本文拟对香菇多糖作进一步醛基氧化修饰,提高其还原性和交联粘附性,以氧化香菇多糖(OLNT)为模板,利用微波辅助加热合成并包覆分散的AuNCs以制备OLNT-AuNCs,将其制作为电化学发光传感器并应用于市售葡萄酒中腐胺的检测,以期为建立食品或生物样品中腐胺的快速检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

主要试剂:精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺、色胺和组胺(纯度 98%),阿拉丁试剂(上海)有限公司;尸胺(纯度98%),美国Sigma-Aldrich公司;透析袋(MW为3 kD),上海联迈生物科技有限公司;香菇多糖(纯度为97%),上海惠诚生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;实验用水为超纯水。

主要仪器:Infinite F50型酶标仪,瑞士FECAN公司;F-7000 型荧光分光光度计,日本日立高新技术公司;JEM-2100 型高分辨率透射电子显微镜(HTEM),日本电子株式会社;Waters 1525型高效液相色谱,美国沃特世公司;PB-10 型PH 计,德国 Sartorius 公司;EL204型电子天平,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;SCIENTZ-10 N型冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;CHI-760E型电化学工作站,上海辰华仪器有限公司;MPIE型电化学发光检测仪,西安瑞迈分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1OLNT-AuNCs制备与表征参照文献[14]的方法制备OLNT。取50 mL质量浓度为20 mg/mL的香菇多糖水溶液置于密封反应管中,于25 ℃恒温水浴条件下缓慢滴加500 μL 1 mol/L的Na5IO6溶液,反应8 h;加入1 mL乙二醇终止反应15 min,再加入4 g NaCl,混匀后调节溶液至中性,透析处理后冻干,即制得OLNT。参照文献[15],采用NaI-淀粉糊精法测定OLNT氧化度。取5 mL氧化反应中止前的香菇多糖水溶液,迅速加入5 mL NaI工作液,避光处理1 h,香菇多糖氧化反应水溶液中未消耗的NaIO4与NaI发生氧化-还原反应,释放出的I2与淀粉指示剂发生显色反应而呈红棕色,用酶标仪在480 nm波长处测定吸光度。通过标准曲线确定反应未消耗的NaIO4质量,利用差减法计算NaIO4消耗量,最后计算OLNT氧化度。

将一定量的OLNT(4 mg/mL)溶解在去离子水中,于140 ℃条件下加热30 min,打破分子内和分子间氢键,形成单链结构,冰水淬冷后与等体积的HAuCl4·4H2O溶液(824 μg/mL)室温下预混30 min,然后在1800 W微波辅助下加热30 s(温度最终达120 ℃左右)以获得AuNCs,加热处理后用冰水淬冷至室温,透析后冻干,即制得OLNT-AuNCs。作为参照样品,利用未氧化处理的香菇多糖,采取上述步骤微波辅助加热合成香菇多糖金纳米复合物(LNT-AuNPs)。

采用HTEM和荧光分光光度计对OLNT-AuNCs的表面形貌和光学性能进行表征。将一定量的AuNCs复合物复溶于水配制成1 mg/mL的溶液,滴加到铜网上,经红外干燥后观察其形貌;荧光激发和发射狭缝宽度分别设定为5.0 nm和2.5 nm。

1.2.2 电极制备将玻碳电极(GCE)经Al2O3抛光后,依次置入水、乙醇、水中进行超声清洗。配制质量浓度为10 mg/mL 的OLNT-AuNCs水溶液,取5 μL该溶液涂布于预处理的电极表面,常温下干燥后,即制得OLNT-AuNCs/GCE,备用。

1.2.3ECL检测利用三电极体系对OLNT-AuNCs进行ECL 测试。OLNT-AuNCs/GCE为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,Pt电极为对电极;电解质溶液为0.1 mol/L K2S2O8(含有0.1 mol/L的KCl和0.1 mol/L的PBS,pH值为7.5);扫描范围为-2～0 V,扫描速率为100 mV/s,光电倍增管为800 V,放大级数为4。

1.2.4 腐胺质量浓度测定为考查所制备OLNT-AuNCs/GCE电极对腐胺的定量检测效果,分别将一系列质量浓度(0.01～40 mg/L)的标准腐胺溶液通过该电极检测系统进行分析鉴定,计算ECL信号猝灭程度ΔIECL(ΔIECL=I0-I,其中,I0为引入腐胺前传感器的ECL强度,I为引入腐胺后的ECL强度)。

为了探究OLNT-AuNCs/GCE电极检测腐胺的特异性,选择尸胺、精胺、亚精胺等脂肪胺及酪胺、苯乙胺、色胺、组胺等非脂肪胺作为腐胺检测干扰物,其中,腐胺和尸胺的质量浓度为0.1 mg/L,其他生物胺的质量浓度均为1 mg/L。

LNT-AuNCs/GCE的发光稳定性检测条件为:在0.1 mol/L K2S2O8体系中,连续扫描OLNT-AuNCs/GCE 的ECL信号20次(扫描条件同1.2.3)。

为评价本文所建立传感器的实用性,对3种市售葡萄酒中腐胺质量浓度进行检测,待测样品均用0.22 μm滤膜过滤。每种样品均取4份,1份不加内标,其他3份用于加标回收率实验,采用OLNT-AuNCs/GCE电化学发光传感器进行检测,每次实验重复3次,取平均值。作为对比,待测葡萄酒样品中生物胺的质量浓度参照《食品中生物胺含量的测定》(GB/T 5009.208—2016)[16]进行检测。

2 结果与分析

2.1 OLNT-AuNCs的表征

图1为OLNT-AuNCs和LNT-AuNPs的HTEM图,其中插入图片为高倍透镜下的单个颗粒图。由图1a)可知,OLNT对AuNCs的分散效果良好,AuNCs的平均粒径约为 2.8 nm。高倍透镜下,晶格条纹清晰可见,约为 0.23 nm,间距几乎相同,与金纳米晶体的典型特征一致,证明制备得到的是小尺寸金纳米簇。由图1b)可知,微波辅助法合成的LNT-AuNPs经再分散后,其平均粒径约为10 nm。在高倍透镜下,其晶格条纹也约为0.23 nm。相较于未经微波辅助加热合成的金纳米粒子(平均粒径约为18 nm)[17],其平均粒径虽有所下降,但明显大于AuNCs。

荧光性质是小尺寸贵金属纳米簇(2 nm左右)的主要特性之一。本研究中的OLNT-AuNCs溶液在可见光下基本呈无色透明状,在 365 nm 波长紫外灯辐照下可发出红色荧光。图2为OLNT-AuNCs的荧光光谱。由图2可知,OLNT-AuNCs在 612 nm 处出现较强的荧光发射峰,表明其具有良好的荧光特性,且为小尺寸金属纳米团簇。综上可知,通过醛基取代、高功率微波辅助加热都可加快多糖还原氯金酸的反应速度,使反应体系初期出现大量晶种,金纳米晶体数量增加,平均粒径相对减小,同时,由于单链多糖复性成三螺旋构象过程中的包覆作用,抑制了AuNCs的进一步生长,从而成功合成了具有良好分散效果的荧光OLNT-AuNCs。

图1 OLNT-AuNCs和LNT-AuNPs的HTEM图Fig.1 HTEM diagrams of OLNT-AuNCs and LNT-AuNPs

2.2 OLNT-AuNCs的ECL行为分析

图3为OLNT-AuNCs/GCE在不同电解质溶液的ECL曲线。由图3可知,没有添加K2S2O8时,在OLNT-AuNCs/GCE上可观察到微弱的ECL发射信号;当添加0.1 mol/L的 K2S2O8后,ECL发射信号明显增强,说明在OLNT-AuNCs电化学发光反应进程中,K2S2O8作为阴离子型共反应剂,起到了增强ECL效率的作用。具体反应如下:

OLNT-AuNCs+e-→OLNT-AuNCs·-

S2O82-+e-→SO42-+SO4·-

OLNT-AuNCs·-+SO4·-→OLNT-AuNCs*+SO42-

OLNT-AuNCs*→OLNT-AuNCs+hv

当在该体系中引入腐胺后,发现腐胺能够明显抑制OLNT-AuNCs在K2S2O8体系中的ECL行为。因此,OLNT-AuNCs的液相ECL体系有望实现腐胺的快速检测。

图2 OLNT-AuNCs的荧光发射光谱Fig.2 Fluorescence emission spectra of OLNT-AuNC

图3 OLNT-AuNCs/GCE在不同电解质条件下的ECL曲线Fig.3 ECL-potential curves of OLNT-AuNCs/GCE recorded in different conditions

2.3 腐胺的定量检测分析

图4为不同质量浓度腐胺对OLNT-AuNCs/GCE检测体系的ECL信号猝灭情况。由图4可知,随着腐胺质量浓度的增大,OLNT-AuNCs/GCE检测体系的ECL信号猝灭程度增加,当腐胺质量浓度达到20 mg/L时,ECL信号已基本完全猝灭。图5为ΔIECL与腐胺质量浓度对数(lgC)之间的线性关系。由图5可知,ΔIECL与lgC线性相关,ΔIECL= 3 159.4 lgC+5 435.5 (R2=0.997 5),线性范围为0.03～18.6 mg/L,检出限为 9 μg/L(S/N=3)。目前,关于食品中腐胺的国标定量限均为mg级(如酒类、醋为3 mg/kg,水产品、肉类等为15 mg/kg)[16],因此本研究建立的检测方法线性范围适中,可覆盖食品中腐胺的定量检测范围。

图4 不同质量浓度腐胺对OLNT-AuNCs/GCE检测体系的ECL信号猝灭情况Fig.4 ECL response of the OLNT-AuNCs/GCE toward different concentrations of putrescine

图5 ΔIECL与腐胺质量浓度对数(lgC)之间的线性关系Fig.5 Linear relationship between the ΔIECL and the logarithm of the putrescine concentration(lgC)

图6 OLNT-AuNCs/GCE对不同生物胺的选择性Fig.6 The selectivity response of the OLNT-AuNCs/GCE towards different biogenic amines

图6为OLNT-AuNCs/GCE对不同生物胺的选择性。由图6可知,非脂肪胺干扰物对腐胺检测影响较小,脂肪胺干扰物尸胺的ΔIECL约为腐胺的50%,这是由于尸胺具有与腐胺相似的结构,表面传感器的选择性高度依赖目标分子结构,具有一定的干扰性,但相同质量浓度的尸胺与腐胺共存时,ΔIECL不超过25%。这与Y.L.Guo等[18]的研究结果类似,即相同质量浓度腐胺与尸胺共存的条件下,对其构建的精胺传感器带来的干扰程度约为30%。电化学传感器具有快速检测的优势,可在数分钟内连续扫描10次以上,但其对化学结构相似的化合物存在选择性较差的问题,笔者将进一步通过调节OLNT氧化度或凝胶程度等方案优化传感器的选择性。另外,在葡萄酒等饮品中,腐胺常见的本底浓度约为尸胺的10倍及以上[19],尸胺带来的干扰相对较小,因此该ECL传感器有望成为快速检测食品中腐胺质量浓度的应用方案。

图7为OLNT-AuNCs/GCE ECL传感器的稳定性。由图7可知,OLNT-AuNCs/GCE的ECL发射信号强且稳定,相对标准差(RSD)仅为1.82%,可用于进一步分析实验。

2.4 葡萄酒中腐胺质量浓度检测效果分析

表1为3种市售干红葡萄酒中腐胺的加标回收实验结果。由表1可知,3种干红葡萄酒中均有腐胺检出,检出质量浓度与国标液相色谱法[16]检出质量浓度相比略高,加标回收率为 91.2%～109.3%,RSD均小于2%。因此,本文建立的传感器重复性较好,回收率较高,能够满足实际样品中腐胺的检测要求。

图7 OLNT-AuNCs/GCE ECL传感器的稳定性Fig.7 Stability of OLNT-AuNCs/GCE ECL sensor

表1 3种市售干红葡萄酒中腐胺的加标回收实验结果Table 1 The recovery analysis of putrescine in three commericially available dry red wines

3 结论

本文通过高碘酸氧化法对香菇三螺旋多糖的侧基进行选择性醛基氧化修饰,提高了其还原性及交联黏附特性;以OLNT为模板,利用微波辅助快速加热原位还原氯金酸合成并包覆分散的AuNCs制备了OLNT-AuNCs。通过HTEM和荧光分光光度计对OLNT-AuNCs的表面形貌和光学性能进行了表征,发现OLNT对AuNCs具有良好的分散效果,AuNCs平均粒径约为2.8 nm,有红色荧光,荧光峰值为612 nm。将OLNT-AuNCs制作为ECL传感器,利用腐胺对传感器的发光猝灭效果,建立了腐胺的快速检测系统;非脂肪胺干扰物对腐胺检测影响较小,尸胺具有一定的干扰性,但当相同质量浓度的尸胺与腐胺共存时,ΔIECL变化不超过25%;该传感器的稳定性良好,连续扫描下ECL信号的RSD仅为1.82%。将该传感器应用于3种市售葡萄酒样品中腐胺的检测,得出加标回收率为 91.2%～109.3%,RSD均小于2%。本研究结果可为食品或生物样品中的腐胺提供一种快速、简单的检测方法,未来将进一步通过调节多糖氧化度或凝胶程度等方案优化传感器的选择性。