杜仲叶提取物绿色合成纳米铂颗粒及其美白作用

张义森,程硕,周娟娟,贾会领,王军,陈雪,吴丽芳

1.安徽医科大学 基础医学院,安徽 合肥 230032;2.中国科学院合肥物质科学研究院 离子束生物工程与绿色农业研究中心,安徽 合肥 230031

0 引言

纳米铂颗粒(Platinum Nanoparticles,PtNPs)具有催化活性高、抗氧化活性强、性能稳定等理化特性,在生物医学领域的应用日益广阔,已被用于抗菌、治疗氧化应激相关疾病、检测生物标志物等方面,也被批准作为添加剂应用于化妆品领域[1-3]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)又名思仲、思仙等,为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木,是我国独有的药材之一,也是世界宝贵的药源植物资源[14]。杜仲不同部位的提取物具有抗氧化、抗衰老、降血压、降血糖等药理作用[15-16],其中杜仲叶含有丰富的木脂素、环烯醚萜、绿原酸、黄酮类、苯丙素、多糖、多酚等化学成分,可作为Pt4+的优良还原剂和稳定剂[17]。目前,已有报道利用杜仲各部位提取物合成Au、Ag等纳米粒子[18-20],但鲜见合成PtNPs的报道,也未见有关绿色合成的PtNPs在皮肤美白方面的研究。基于此,本研究拟利用杜仲叶提取物作为还原剂和稳定剂,采用一步法简单且高效地绿色合成PtNPs,通过单因素试验分析反应条件对PtNPs颜色和浓度的影响,并研究PtNPs对酪氨酸酶活性的抑制作用,以期为PtNPs应用于美白类护肤品提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

主要材料与试剂:杜仲叶提取物,陕西斯诺特生物技术有限公司;氯铂酸(分析纯),BBI生命科学有限公司;人恶性黑色素瘤细胞系(A375),美国模式培养物研究所(ATCC);高糖DMEM培养基,上海源培生物科技股份有限公司;血清,上海双洳生物科技有限公司;青链霉素混合液,北京索莱宝生物科技有限公司;CCK8试剂盒(MA0218-5),大连美仑生物技术有限公司;蘑菇酪氨酸酶(酶活为25 000 U),美国Sigma-Aldrich公司;左旋多巴(分析纯),阿拉丁生化科技股份有限公司。其他试剂均为分析纯。

主要仪器:SCIENTZ-12 N/D型冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;ScanDrop型紫外分光光度计,德国耶拿分析仪器股份公司;JEM2100F型透射电子显微镜(TEM),日本电子株式会社(JEOL)公司;IS5型傅里叶变换红外光谱仪,赛默飞世尔科技公司;Smartlab型X射线衍射仪,日本理学株式会社公司;PL-9602型酶标仪,北京普朗新技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲叶提取物溶液制备准确称取5 g杜仲叶提取物溶解于超纯水并定容至100 mL,将混合溶液斡旋至充分溶解,超声15 min后,在4000 r/min条件下离心10 min,取上清液,过0.45 μm微孔滤膜,即得杜仲叶提取物溶液,置于冰箱(-20 ℃)中储存。根据实验需要,将杜仲叶提取物溶液按不同质量浓度(2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL、10.0 mg/mL和12.5 mg/mL)稀释,备用。

1.2.2 氯铂酸水溶液制备准确称取1 g氯铂酸溶解于超纯水并定容至48.8 mL,制备浓度为50 mmol/L的氯铂酸水母液。根据实验需要,将氯铂酸水母液稀释成不同浓度(0.5 mmol/L、1.5 mmol/L、2.5 mmol/L、3.5 mmol/L和5.0 mmol/L)氯铂酸水溶液,备用。

1.2.3PtNPs制备将4 mL杜仲叶提取物溶液与1 mL氯铂酸水溶液混合,用超纯水定容至20 mL,加热搅拌至溶液变为棕色或黑色,停止反应并冷却至室温;将反应液置于12 000 r/min条件下离心20 min, 除去上清液,将沉淀用超纯水超声分散10 min后,再次离心15 min,重复3次。将所得沉淀一部分用超纯水溶解,储存于离心管中,置于冰箱(4 ℃)中储存,用于测定酪氨酸酶活性;一部分经真空冷冻干燥得PtNPs粉末,用于性能表征。

1.2.4PtNPs溶液浓度测定将50 μL PtNPs溶液加入5 mL HNO3中,过夜进行硝化反应后,将硝化液蒸干,并用5 mL超纯水重新溶解,再将溶液通过0.45 μm微孔滤膜过滤,采用电感耦合法测定Pt元素浓度,从而计算PtNPs溶液浓度。

1.2.5 单因素试验1)反应时间的影响:在反应温度为90 ℃,氯铂酸浓度为2.5 mmol/L,杜仲叶提取物质量浓度为10.0 mg/mL的条件下,考查不同反应时间(30 min、45 min、60 min、75 min和90 min)对PtNPs颜色及浓度的影响。

2)反应温度的影响:在反应时间为60 min,其他反应条件同步骤1)的情况下,考查不同反应温度(50 ℃、70 ℃和90 ℃)对PtNPs颜色及浓度的影响。

3)氯铂酸浓度的影响:在其他反应条件同步骤1)的情况下,考查不同氯铂酸浓度(0.5 mmol/L、1.5 mmol/L、2.5 mmol/L、3.5 mmol/L和5.0 mmol/L)对PtNPs颜色及浓度的影响。

4)杜仲叶提取物质量浓度的影响:在其他反应条件同步骤1)的情况下,考查不同杜仲叶提取物质量浓度(2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL、10.0 mg/mL和12.5 mg/mL)对PtNPs 颜色及浓度的影响。

1.2.6PtNPs溶液浓度、表面形貌与结构表征1)紫外吸收光谱(UV-vis)测定。PtNPs溶液的浓度与其吸光度呈正相关,因此使用紫外分光光度计测定PtNPs溶液在200～729 nm处的吸光度,初步确定是否合成了PtNPs及合成PtNPs的适宜条件,并选择适宜条件下合成的PtNPs进行后续实验。

2)表面形貌表征。将5 μL均匀分散的PtNPs溶液滴加于覆炭铜网上,室温干燥后,固定在TEM采样台上,加速电压为200 kV。

3)X射线衍射光谱(XRD)分析。在λ为0.154 06 nm、电流为20 mA、电压为45 kV和2θ范围为10°～90°的条件下,以4°/min的扫描速率测试PtNPs样品。

4)傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析。采用KBr压片法测定PtNPs样品的FTIR谱图,扫描次数为16次,分辨率为4 cm-1,检测波数范围为400～4000 cm-1。

1.2.7 酪氨酸酶活性测定1)蘑菇酪氨酸酶活性测定。酪氨酸酶是黑色素产生的重要调节酶,蘑菇酪氨酸酶常用于体外检测美白试剂对酪氨酸酶活性的影响。分别取不同质量浓度的PtNPs溶液100 μL,加入50 μL蘑菇酪氨酸酶溶液(100 U/mL)后混合均匀,于37 ℃避光条件下水浴10 min,再加入200 μL质量浓度为1 mg/mL的左旋多巴,在37 ℃避光条件下水浴30 min,测定反应溶液在475 nm处的吸光度。蘑菇酪氨酸酶活性计算公式为:

蘑菇酪氨酸酶活性=(T-T0)/(C-C0)×100%

其中,T、T0、C和C0分别表示PtNPs与酶反应组、PtNPs组、酶反应组和空白对照组的吸光度。

2)细胞培养和细胞活力测定。使用高糖DMEM培养基(添加体积分数为10%的FBS和体积分数为1%的青霉素-链霉素混合溶液)培养A375细胞,置于37 ℃、体积分数5%的CO2的加湿培养箱中,细胞1∶3传代至对数生长期,利用胰酶进行消化计数以进行后续实验。使用CCK8试剂盒检测PtNPs对A375细胞活力的影响。将A375细胞(2.0×103细胞/孔)在96孔细胞培养板孵育24 h后,用不同浓度的PtNPs溶液处理;再孵育24 h后,加入100 μL培养基(含体积分数为10%的CCK-8试剂),继续孵育4 h;用酶标仪测定450 nm处的吸光度。细胞活力计算公式为:

细胞活力=A1×A0× 100%

其中,A1和A0分别表示处理细胞和未处理细胞的吸光度。

3)酪氨酸酶活性和黑色素含量测定。采用文献[21]中的方法测定A375细胞内酪氨酸酶的活性,将A375细胞接种到细胞培养皿(35×10 mm)中,贴壁培养24 h后,用不同浓度的PtNPs溶液处理细胞并孵育24 h,用PBS溶液洗涤细胞2次,加入裂解缓冲液(含有PMSF的体积分数为1%的Triton X-100)。在-20 ℃条件下冷冻A375细胞30 min,4 ℃条件下解冻并收集细胞。离心并收集上清液,用BCA法进行蛋白定量。将上清液与200 μL左旋多巴溶液(4 mg/mL)混匀,37 ℃水浴3 h,用紫外分光光度计在490 nm处测定吸光度。酪氨酸酶活性计算公式为:

酪氨酸酶活性=R1/R0×100%

其中,R1和R0分别表示处理细胞和未处理细胞的吸光度。

将A375细胞在不同浓度的PtNPs溶液中孵育24 h后,在培养皿中加入500 μL PBS缓冲液并暴露在UVB灯(80 mJ/cm2)下,继续孵育24 h,用PBS缓冲液洗涤细胞2次后加入RIPA裂解液,离心并收集上清液,进行蛋白定量。将上清液与150 μL NaOH溶液(1 mol/L,含体积分数10%的DMSO)混匀,在60 ℃水浴中反应30 min。用紫外分光光度计在450 nm处测定反应溶液的吸光度,黑色素含量计算公式为:

黑色素含量=T1/T0×100%

2 结果与讨论

2.1 不同反应条件对合成PtNPs的影响

图1为不同反应条件对PtNPs溶液颜色及吸光度的影响。由图1a)可知,随着反应时间的延长,PtNPs溶液颜色由淡棕色变为棕色或黑色,且紫外吸收峰均出现在230 nm左右,表明反应生成了PtNPs;且PtNPs溶液的吸光度先增大后减小,表明PtNPs溶液的浓度先升高后降低。这主要是因为反应开始时,Pt4+逐渐被还原,但随着反应时间的延长,生成的PtNPs逐渐聚集继而产生沉淀。因此,选择反应时间为60 min较适宜。

由图1b)可知,随着反应温度的升高,PtNPs溶液颜色逐渐加深,当反应温度为90 ℃时,在230 nm附近出现了明显的紫外吸收峰,表明此时PtNPs溶液的浓度较高。因此,选择反应温度为90 ℃较适宜。

由图1c)可知,随着氯铂酸浓度的升高,PtNPs溶液的颜色逐渐由棕色变为黑色,吸光度先增大后减小,表明PtNPs溶液的浓度先升高后降低。当氯铂酸浓度为3.5 mmol/L时,PtNPs溶液浓度最高。因此,选择氯铂酸浓度为3.5 mmol/L较适宜。

由图1d)可知,随着杜仲叶提取物质量浓度的升高,PtNPs溶液的吸光度先增大后减小,表明PtNPs溶液的浓度先升高后降低。当杜仲叶提取物质量浓度为10.0 mg/mL时,PtNPs溶液的浓度最高。因此,选择杜仲叶提取物质量浓度为10.0 mg/mL较适宜。

2.2 表面形貌与结构表征分析

2.2.1TEM分析图2为PtNPs的TEM图和粒径分布图。由图2可知,PtNPs的粒径较小且分布均匀,粒径平均尺寸为(2.27±0.65) nm。

2.2.2XRD分析图3为PtNPs的XRD谱图。由图3可知,所制备的PtNPs为晶体形式。与粉末衍射标准图谱(JCPDS #04-0802)相比,PtNPs样品在(111)、(200)、(220)和(311)晶体平面上都出现了明显的衍射峰,且未出现杂峰,表明形成了高纯度的面心立方结构[9]。

图2 PtNPs的TEM图和粒径分布图Fig.2 TEM and and particle size distribution of PtNPs

图3 PtNPs的XRD谱图Fig.3 XRD pattern of PtNPs

图4 杜仲叶提取物和PtNPs的FTIR图谱Fig.4 FTIR spectrum of Eucommia ulmoides Oliver leaf extract and PtNPs

2.3 PtNPs对蘑菇酪氨酸酶活性的影响

图5为杜仲叶提取物、PtNPs和曲酸对蘑菇酪氨酸酶活性的影响。由图5a)可知,PtNPs对蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用明显优于杜仲叶提取物,当PtNPs的质量浓度为10.0 μg/mL时,蘑菇酪氨酸酶活性降低至35.70%,IC50为(6.98±0.76) μg/mL。

图5 杜仲叶提取物、PtNPs和曲酸对蘑菇酪氨酸酶活性的影响Fig.5 Effects of Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts, PtNPs and Kojic acid on mushroom tyrosinase activity

由图5b)可知,与标准美白剂曲酸(IC50为(77.89±4.84) μg/mL)相比,PtNPs对蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用更强。

2.4 PtNPs对A375细胞活力的影响

图6为PtNPs和杜仲叶提取物对A375细胞活力的影响,其中*表示P<0.05,下同。由图6可知,当PtNPs的质量浓度为0～5.0 μg/mL时,A375细胞的生长并未受到明显影响;当PtNPs的质量浓度为10.0 μg/mL时,A375细胞的生长受到轻微的抑制。由图6b)可知,杜仲叶提取物质量浓度为0～100.0 μg/mL时,对A375细胞生长的影响不明显。因此,在实验选取质量浓度范围内,PtNPs和杜仲叶提取物对A375细胞生长的没有明显的影响。

2.5 PtNPs的抗酪氨酸酶活性分析

酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶,其细胞内活性直接影响黑色素的合成[22-23]。图7为PtNPs的抗酪氨酸酶活性,其中NC表示空白对照组,** 表示P<0.01,*** 表示P<0.001。由图7a)可知,PtNPs可显著抑制A375细胞内的酪氨酸酶活性。当PtNPs的质量浓度分别为0.1 μg/mL、1.0 μg/mL和5.0 μg/mL时,酪氨酸酶活性分别降低至70.62%、61.18%和44.96%,而杜仲叶提取物对A375细胞内酪氨酸酶活性无明显抑制作用。由图7b)可知,当A375细胞暴露于UVB下时,A375细胞内的黑色素含量明显增加。用PtNPs处理A375细胞后,黑色素含量明显降低,表明PtNPs可抑制A375细胞内黑色素的合成,这进一步证明了PtNPs具有抗酪氨酸酶活性。

图6 PtNPs和杜仲叶提取物对A375细胞活力的影响Fig.6 Effects of PtNPs and Eucommia ulmoidesOliver leaf extract on A375 cell viability

目前,已有相关文献[24-25]报道了AgNPs对酪氨酸酶的抑制作用,但鲜见关于PtNPs对酪氨酸酶活性的研究。AgNPs是商业化程度最高的纳米粒子之一,广泛应用于家居用品、纺织品、化妆品等领域。然而,有研究[26]表明,AgNPs具有较高的细胞毒性。本研究合成的PtNPs细胞毒性较小,可显著抑制体外和A375细胞内酪氨酸酶活性及黑色素的合成,有望达到皮肤美白的效果。

图7 PtNPs的抗酪氨酸酶活性Fig.7 Anti-tyrosinase activity of PtNPs

3 结论

本文以杜仲叶提取物为还原剂和稳定剂,采用一步法绿色合成了PtNPs,通过单因素试验分析了反应条件对PtNPs颜色和浓度的影响,并研究其对酪氨酸酶活性的影响。结果表明,在一定范围内改变反应条件可调控PtNPs的颜色和质量浓度,PtNPs的适宜制备条件为反应时间60 min、反应温度90 ℃、氯铂酸浓度3.5 mmol/L、杜仲叶提取物质量浓度10.0 mg/mL;PtNPs粒径的平均尺寸为(2.27±0.65) nm,具有面心立方结构,分布较均匀;PtNPs对体外酪氨酸酶活性有较强的抑制作用,IC50为(6.98±0.76) μg/mL,与标准美白剂曲酸相比,其对酪氨酸酶活性的抑制作用更强,且明显降低了A375细胞内的酪氨酸酶活性和UVB诱导的黑色素含量,即PtNPs可通过抑制酪氨酸酶活性来降低黑色素合成,达到皮肤美白的效果。

利用杜仲叶提取物绿色合成PtNPs可有效解决化学法使用有毒试剂及物理法成本高昂的问题,该方法简单、高效、环保,制备的PtNPs适用于生物医学领域,可为PtNPs应用于美白类护肤品的开发提供理论参考。