加拿大烟叶与云南KRK26烟叶香气成分差异分析

帖金鑫,张青松,李永生,廖付,吴继忠,白冰,杨靖,李石头

1.浙江中烟工业有限责任公司 宁波卷烟厂,浙江 宁波 315504;2.浙江中烟工业有限责任公司 技术中心,浙江 杭州 310000;3.郑州轻工业大学 烟草科学与工程学院,河南 郑州 450001

0 引言

位于加拿大最南部的安大略省,自然条件良好,气候温和、昼夜温差大,降雨量、日照、土质均适于烟草生长[1],其优越的生态条件使得产自该地的烟叶具有明亮度高、香气优雅、劲头适宜、工业可用性高等优点,也称为加拿大烟叶。但加拿大烟叶的产量较小,不能很好地满足部分国产品牌卷烟配方和生产的需要,因此寻找和开发相似的国产烟叶替代加拿大烟叶,成为解决该问题的关键[2]。研究[3-5]发现,烟叶香气风格和感官品质与其化学成分的种类及含量密切相关,通过比较加拿大烟叶与国内优质烟叶香气成分的差异,有助于揭示加拿大烟叶香气风格形成的内在因素,为国产替代烟叶的确定提供理论依据。

代谢组学是一种识别和量化小分子代谢物的新型研究手段,它从整体角度出发,运用现代检测技术对食品、植物、生物样品中尽可能多的代谢产物进行分析检测[6-10],通过主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)等方法找出不同组别样本的差异代谢物(差异成分),已在种类鉴别[11-14]、食品加工前后成分变化[15-16]、中药产地溯源[17-18]、烟叶香型区分[19-20]等领域得到了广泛应用。

云南KRK26烟叶为引进津巴布韦烟叶[21],其与加拿大烟叶同属优质烟叶,但二者香气风格存在差异。鉴于此,本文拟以加拿大烟叶和云南德宏KRK26烟叶为研究对象,借鉴代谢组学研究方法,采用二维气质联用技术和多元统计分析方法,通过二者香气成分的差异性分析,探讨其风格特征的不同成因,以期为烟叶原料的开发、应用提供数据支撑与参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

主要材料:加拿大烟叶C3F MK、津引云南德宏KRK26烟叶C3F,浙江中烟工业有限责任公司。

主要仪器:8860-5977B型气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦公司;SSM 1810型固态热调制器,雪景电子科技(上海)有限公司。

主要试剂:二氯甲烷(色谱纯),天津市凯通公司;正己烷(色谱纯),山东禹王公司;异丙醚(色谱纯),东京化成株式会社;异丙醇(色谱纯),德国默克公司;无水硫酸钠、无水乙醇(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;2,6-二氯甲苯、硝基苯、反式-2-己烯酸(纯度均大于99%),百灵威科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 内标标准溶液配制准确称取2,6-二氯甲苯、硝基苯和反式-2-己烯酸,分别用二氯甲烷定容,配制成质量浓度分别为0.556 7 mg/mL、0.548 7 mg/mL和0.827 3 mg/mL的中性、碱性和酸性内标标准溶液。

1.2.2 烟叶挥发性成分提取挥发性成分的提取方法参照文献[22],并略有改进。不同批次的加拿大烟叶和云南KRK26烟叶各抽取5份,粉碎后过40目筛,共10份样品。称取30.0 g烟末于1000 mL圆底烧瓶中,加入400 mL去离子水,另一侧烧瓶加入100 mL二氯甲烷,同时蒸馏萃取2.5 h后,萃取液先用质量分数为5%盐酸水溶液(30 mL×3)洗涤,然后用质量分数为5%氢氧化钠水溶液(30 mL×3)洗涤,得到中性萃取液;盐酸水溶液合并后,加氢氧化钠溶液调节pH值至12,用二氯甲烷(30 mL×3)萃取,合并有机相得到碱性萃取液;氢氧化钠水溶液合并后,加盐酸溶液调节pH值至2,用二氯甲烷(30 mL×3)萃取,合并有机相得到酸性萃取液。在中性、酸性、碱性萃取液中加入适量的无水Na2SO4,冷藏过夜后过滤,常压浓缩至1 mL,进行GC-MS分析,每个样品重复3次,定量结果取平均值。

1.2.3 分析条件1)色谱条件。中性和碱性组分:进样量为1 μL,进样口温度为280 ℃,分流比为10∶1;第一维色谱柱为DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二维色谱柱为DB-17 MS(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),载气为氦气,流量为1.2 mL/min;程序升温起始温度为100 ℃,保持2 min,以4 ℃/min的速率升温到270 ℃,保持5 min。

酸性组分:进样量为1 μL,进样口温度为280 ℃,分流比为10∶1;第一维色谱柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二维色谱柱为DB-17 MS(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),载气为氦气,流量为1.2 mL/min ;程序升温起始温度为40 ℃,保持2 min,以6 ℃/min升温到250 ℃,保持5 min。

调制柱为HV调制柱(1.2 m×0.25 mm),调制周期为5 s,解析时间为1 s;N2补偿气为0.15 MPa,同步GC升温程序,调制器进口温度比柱箱高30 ℃,调制器出口温度比柱箱高120 ℃,冷阱保持-50 ℃。

2)质谱条件。电子轰击源(EI),电离能为70 eV;离子源温度为230 ℃,MS传输线温度为280 ℃,四极杆温度为150 ℃;EM电压为862 V;采集质量范围为41～350 amu,采集速度为23 Hz,溶剂延迟时间分别为中性和碱性组分时2.5 min,酸性时5 min。

3)谱图处理。采用全二维数据处理工作站软件Canvas载入数据,自动绘制全二维TIC轮廓图,并对图中信噪比大于10的峰自动识别,标识出的每一个峰点即代表1种化合物,每个化合物由1对保留时间确定,X轴方向为第1维保留时间/min,Y轴方向为第2维保留时间/s,通过正构烷烃进行保留指数计算。在Canvas软件上,通过对每种化合物的质谱图进行NIST20标准质谱数据库比对检索、结合保留指数(Retention Index,RI)等信息,对化合物进行定性分析,同时根据峰面积,利用内标校正得到各香气成分的相对含量。

1.2.4 数据处理采用Excel、SPSS19及多元统计软件SIMCA14.1进行数据处理。

1.2.5 差异成分筛选采用多元统计分析方法,对两组样本首先进行PCA,以便初步了解各组样本间的总体成分差异和组内样本间的变异度大小。根据OPLS-DA预测模型稳定可靠性,利用多维统计变量重要性投影(Variable Importancein Project,VIP)值、独立样本T检验P值及差异倍数(FC值)筛选差异成分。

2 结果与讨论

2.1 两种烟叶挥发性成分分析

运用二维气质联用技术分别对加拿大烟叶和云南KRK26烟叶中的中性、碱性和酸性成分进行分离鉴定,种类及含量见表1,其中中性成分按照来源分为类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物、棕色化反应产物、苯丙氨酸类降解产物等,碱性成分主要为生物碱,酸性成分主要分为挥发性有机酸、半挥发性有机酸和酚类。由表1可知,加拿大烟叶和云南KRK26烟叶共鉴定出117种香气成分,加拿大烟叶有114 种,云南KRK26烟叶有113 种,其中110 种为两者共有。中性香气成分有63种,其中类胡萝卜素降解产物均为21种,但含量差异较大,加拿大烟叶含量较高的分别是巨豆三烯酮、金合欢基丙酮、(E)-β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、二氢大马酮、香叶基丙酮、5,6-环氧-β-紫罗兰酮和3-氧代-α-紫罗兰醇,云南KRK26烟叶含量较高的分别是巨豆三烯酮、金合欢基丙酮、(E)-β-大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、二氢大马酮、5,6-环氧-β-紫罗兰酮、脱氢二氢-β-紫罗兰酮和3-氧代-α-紫罗兰醇;茄酮作为典型的西柏烷类降解产物,在加拿大烟叶、云南KRK26烟叶中的含量分别为11.54 μg/g、16.57 μg/g;此外,二者的棕色化反应产物均为11种;苯丙氨酸类降解产物均为4种;余下主要为含倍半萜结构的醇、醛、酮、萜烯等,共26种。两种烟叶碱性香气成分共18种,主要为吡啶和喹啉类化合物,其中加拿大烟叶16种,云南KRK26烟叶18种。酸性香气成分共36种,包括挥发性有机酸、半挥发性有机酸和酚类,其中加拿大烟叶35种,云南KRK26烟叶34种。

2.2 两种烟叶香气差异成分分析

两种烟叶样本的PCA得分图如图1所示,其中每个点代表1个独立样品,C代表加拿大烟叶样本,Y代表云南KRK26烟叶样本。由图1可知,2个主成分的累计贡献率达到90.1%,2组样品之间的分离趋势明显,表明加拿大烟叶和云南KRK26烟叶之间存在明显差异。进一步采用具有监督的模式识别方法OPLS-DA对数据进行处理,提取相关性较小变量的主要信息,除去不相关的差异以筛选差异变量,模型的可解释变量R2(R2X=0.752、R2Y=1.000)及可预测度Q2(Q2=0.991)均较高,表明该模型的稳定性和预测性较好,可较好反映两种烟叶样品之间的香气差异成分。为验证模型是否存在过拟合现象,对模型进行了200次响应排序,结果如图2所示。由图2可知,R2和Q2的截距分别为0.641和-0.498,说明模型有效,不存在过拟合现象。

基于OPLS-DA结果,根据获得的多变量分析OPLS-DA模型的VIP值,以其表示对应香气成分的组间差异在模型各组样本分类判别中的影响强度,一般认为VIP≥1的物质为差异显著,可初步筛选出两种烟叶间的差异成分。对云南KRK26烟叶和加拿大烟叶进行筛选,共得到的差异成分9类65种(P<0.001),结果见表2。由表2可知,整体上,云南KRK26烟叶和加拿大烟叶差异成分(65 种)占共有香气成分(117种)的50.6%,说明两种烟叶香气成分差异显著。其中差异成分较多的种类是类胡萝卜素降解产物和有机酸,占比分别为13.7%和15.4%,其次为其他中性香气成分(14.5%)和生物碱(5.1%),苯丙氨酸类降解产物有2种差异成分,西柏烷类降解产物和棕色化反应产物各有1种差异成分。

表1 两种烟叶中挥发性香气成分种类及含量Table 1 Types and content of volatile aroma components of two tobacco leaves μg/g

表1(续)

图1 两种烟叶样本的PCA得分图Fig.1 PCA score plot for two types of tobacco leaves

图2 两种烟叶样本OPLS-DA 200次交叉验证图Fig.2 Cross-validation plot of OPLS-DA with 200 permutation test for two types of tobacco leaves

为方便观察代谢物变化规律,简单、直观地反映代谢物的变化情况,对差异显著的代谢物进行归一化处理,并绘制聚类热图(见图3)。由图3可知,两种烟叶香气成分含量整体上差异明显。结合表1和表2可知,类胡萝卜素降解产物是烟叶中重要的致香成分,其种类及含量与烟叶香气风格的形成至关重要,16种VIP>1的类胡萝卜素降解产物,在云南KRK26烟叶中的含量均显著高于加拿大烟叶,包括巨豆三烯酮、大马酮、二氢大马酮等,尽管差异倍数不大,但由于其含量较高,香气阈值较低,可认为是两种烟叶的关键差异成分。中性香气成分中,新植二烯、螺岩兰草酮和α-香附酮含量较高,且在加拿大烟叶中均高于或远高于云南KRK26烟叶。此外,有机酸是两种烟叶中化合物数量较多、含量较高且差异较大的一类物质。根据结构差异,烟叶中的脂肪酸又可分为挥发性有机酸和半挥发性有机酸,云南KRK26烟叶挥发性有机酸含量高于加拿大烟叶,而加拿大烟叶半挥发有机酸含量明显高于云南KRK26烟叶,其可能与烟叶香气风格的形成密切相关。

表2 两种烟叶中差异成分分析结果Table 2 Analysis of differential components between two types of tobacco leaves

为比较两种烟叶香气成分定量信息发生的差异倍数变化,将差异倍数进行处理(log2FC),变化排在前30的差异表达代谢成分如图4所示。由图4可知,加拿大烟叶含7种有机酸(壬酸、异丁酸、月桂酸、油酸、棕榈油酸、3-甲基戊酸和肉豆蔻酸),2 种酚类(2-甲氧基-5-甲基苯酚和4-乙烯基愈创木酚),6种其他中性香气成分(香叶醇、α-香附酮、氧化石竹烯、螺岩兰草酮、乙酸乙酯和香叶基香叶醇)的含量显著高于云南KRK26烟叶;而云南KRK26烟叶含4 种类胡萝卜素降解产物(β-二氢紫罗兰酮、4-氧代异佛尔酮、香叶基丙酮和二氢-β-脱氢紫罗兰酮),2种生物碱(4-苯基吡啶和喹啉甲醛),1 种酚类(苯酚),2 种脂肪酸(丁酸和异戊酸),1 种苯丙氨酸类降解产物(苯乙醇),5 种其他中性香气成分(1-戊烯-3-酮、6-甲基-5-乙基-3-庚烯-2-酮、异戊烯醛、γ-辛内酯和6-甲基-2-庚酮)的相对含量显高于加拿大烟叶。

图3 差异成分聚类热图Fig.3 Heat map for differential components

图4 两种烟叶中含量差异最大的30 种化合物Fig.4 Thirty most significantly differential components between two types of tobacco leaves

2.3 两种烟叶风格差异分析

从烟气特征来看,加拿大烟叶香气细腻、透发、圆润感好,香气量尚足,烟气浓度中等、柔和,吸味甜、劲头足、余味舒适;云南KRK26烟叶香气丰满清雅,自然醇和,烟草本香凸显,刺激性稍大,吸味津甜,细腻圆润。两种烟叶感官品质及香气风格相似的同时也存在差异,这与其香气成分种类及含量有关。分析结果表明:加拿大烟叶与云南KRK26烟叶的碱性香气成分差异不大,而酸性香气成分和中性香气成分差异明显。加拿大烟叶半挥发性中长链脂肪酸含量明显高于云南KRK26烟叶,半挥发性有机酸可柔和烟气,提升烟气圆润感和透发性,是烟叶形成浓香型风格的重要影响因素。云南KRK26烟叶中类胡萝卜素降解产物和西柏烷类降解产物含量占比均较高,其中巨豆三烯酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、茄酮等成分对增加烟气的清甜感及凸显烟草本香具有重要作用,而加拿大烟叶中萜烯、萜酮含量较高,类胡萝卜素降解产物含量虽低于云南KRK26烟叶,但仍处于较高的水平,这使得加拿大烟叶形成了独特的“浓中透清”烟气风格。

王晓辉[23]以烟叶中β-紫罗兰酮、β-二氢大马酮和巨豆三烯酮总量的聚类分析结果为分组依据,建立了化学分组方法用来指导叶组配方,发现配方模块的香气特性及烟气特性与类胡萝卜素标志性转化产物含量呈明显的相关性,类胡萝卜素转化产物含量高的烟叶,香气特性较好,即烟香丰富、香气量足,而类胡萝卜素转化产物含量中等的烟叶,烟气特性较好,即烟气细腻、烟香明快、刺激性小。从本文研究结果可知,云南KRK26烟叶中巨豆三烯酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、β-紫罗兰酮等香气成分总量高,香气丰满、香气量充足,但酸性成分含量相对较低,使得烟气刺激性稍大,烟气略显粗糙,柔顺性有待提升,配伍性稍差,可作为主料烟使用,以彰显卷烟香气风格;加拿大烟叶中类胡萝卜素降解产物含量适中,半挥发性有机酸含量较高,使得其烟气尽管香气量一般,但舒适性、柔顺性较好,在叶组配方中使用时,自身的香气风格不易显露,在提升香气格调的同时,又能有效降低烟气刺激性,使烟气柔和细腻,改善烟气特性。

3 结论

本文通过主成分分析、正交偏最小二乘判别分析等方法对加拿大烟叶和云南KRK26烟叶香气成分进行了对比分析,筛选得到差异成分65种,占共有香气成分的50.6%。加拿大烟叶中有22 种成分含量较高,主要为半挥发性有机酸类和倍半萜类;云南KRK26烟叶中有43种成分含量较高,主要为类胡萝卜素降解产物,如巨豆三烯酮、大马酮、二氢大马酮等。类胡萝卜素降解产物和半挥发性有机酸含量的差异与两种烟叶香气风格密切相关,因此,在加拿大烟叶替代筛选时,可将化学成分作为判定指标,重点关注类胡萝卜素降解产物含量中等、半挥发性有机酸含量较高的烟叶,并在叶组配方中将其作为调味烟叶使用,可与浓香型或清香型主料烟进行较好的配伍,提升烟草制品品质。