纳米孔测序技术在血流感染病原学诊断中的应用和展望

郭伟　范帅华　杜鹏程　郭军

摘要：血流感染（BSI）是由细菌、真菌和病毒等微生物引起的血液播散性疾病，可导致菌血症、败血症、感染性休克，严重危及人类生命健康。明确病原体是精准治疗BSI的重要核心。传统血培养是病原体诊断的金标准，其不足是耗时长，会产生假阴性结果等，在临床实践中具有一定的局限性。纳米孔测序作为新一代测序技术，能快速检测病原体，完成耐药基因、毒力基因检测，可优化临床治疗。本文就纳米孔测序技术在BSI中的应用现状进行综述。

关键词：纳米孔测序；血流感染；高通量核苷酸测序

中图分类号： R446.5文献标志码： A文章编号：1000-503X（2023）02-0317-05

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.14995

Application and Prospect of Nanopore Sequencing Technology in Etiological Diagnosis of Blood Stream Infection

GUO Wei FAN Shuaihua DU Pengcheng GUO Jun1，3

ABSTRACT：Blood stream infection （BSI），a blood-borne disease caused by microorganisms such as bacteria，fungi，and viruses，can lead to bacteremia，sepsis，and infectious shock，posing a serious threat to human life and health.Identifying the pathogen is central to the precise treatment of BSI.Traditional blood culture is the gold standard for pathogen identification，while it has limitations in clinical practice due to the long time consumption，production of false negative results，etc.Nanopore sequencing，as a new generation of sequencing technology，can rapidly detect pathogens，drug resistance genes，and virulence genes for the optimization of clinical treatment.This paper reviews the current status of nanopore sequencing technology in the diagnosis of BSI.

Key words：nanopore sequencing；blood stream infection；high-throughput nucleotide sequencing

Acta Acad Med Sin，2023，45（2）：317-321

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指細菌、真菌和病毒等病原微生物进入血流引起的播散感染，可导致菌血症、败血症和脓毒症，严重者可引起休克、多脏器功能衰竭乃至死亡。近年来，随着艾滋病患者和移植术后患者等免疫力低下患者的人数增多、医疗侵袭性操作项目的不断增加和广谱抗菌药物、皮质激素等药物的广泛应用，BSI的发病率及病死率逐年上升［1］。一项覆盖了3.2亿人口、基于国家死亡检测系统系统的回顾性分析发现：2015年标化BSI相关死亡率为6.67/万，相当于全国BSI死亡例数达到102.6万例（通过2015年的普查人口估算）。2019年末开始的由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型导致的新型冠状病毒感染疫情的暴发，再次敲响了公共卫生警钟，提示着感染性疾病，尤其是病毒引起的呼吸道传染病仍严重威胁人类的生命健康。Li等［2］指出，在临床中许多严重或危重新型冠状病毒感染患者特有典型的休克症状，常常是BSI中的病毒性败血症临床表现。BSI已经成为了严峻的临床和公共卫生安全问题，严重影响了人们的生命安全，给公共卫生健康带来了巨大挑战［3］。

明确病原体是治疗BSI的核心，病原体是实施精准治疗的靶标，目前血培养依然是诊断BSI的金标准，但这通常需要2～7 d才能完成病原菌鉴定和抗生素敏感性试验［4］，导致依据病原学检测结果优化和精准实施抗菌药物治疗的严重延误，在最初24 h内仍未接受治疗或接受不适当抗菌治疗的脓毒症患者的死亡风险会因此而增加［5］，此外病原学诊断的延迟促进了广谱抗菌药物的不当使用和过度使用，使得病原菌耐药性增强、高耐药病原体在临床流行，导致患者发生医院感染的风险升高，进一步增加了抗菌治疗的难度，形成恶性循环［6］。此外，还有许多病原微生物，如病毒、支原体等无法在常规临床实验室进行培养和检测。因此为了探索建立简单、快速、准确的病原学诊断方法，微生物学家、临床检验学家等开展了大量研究建立新型病原检测方法，根据方法学原理的不同可分为酶联免疫吸附测定、血清抗体检测、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、二代宏基因组测序等［7］。这些方法有优势的同时也存在明显不足，比如结果容易受干扰、假阴性高，测序读长相对较短，设备成本高昂、体积大，操作复杂，应用受到限制，特别是报告病原学检测结果的时间一般会超过24 h。近年来迅速发展的纳米孔测序技术很好地解决这些问题，由于其具有测序读长较长、数据实时产出（“边解链边测序”）等特点，为快速检测病原微生物提供了可能，本文就纳米孔测序技术在BSI病原微生物检测中的应用进行综述。

测序技术的发展及在病原检测中的应用现状

1977年，Sanger等［8］描述了一种测定 DNA 核苷酸序列的方法——双脱氧末端终止法，即Sanger法。这种方法现在称为一代测序，在后来的人类基因组研究计划中起到了主导作用。但一代测序能够测定的DNA序列长度（即读长：是测序反应所能测得序列的长度，如果DNA序列长度高于读长，那么必须把DNA序列分割成长度在读长以内短序列才能测序）和范围都很有限，且费用高昂。2004年，美国国家人类基因研究所提出了在10年内达成以1000美元成本对人类基因组测序的目标，促进了新一代测序（next generation sequencing，NGS）的研发。NGS也称为二代测序、高通量测序、深度测序等，NGS能实现更大范围基因组的检测，在一次运行中能够并行进行数百万至数万亿次测定［9-10］；目前，二代宏基因组测序病原检测方法实现了对临床样本中病原微生物的快速直接检测，无需进行病原培养，可在24～36 h左右获得检测结果，极大推进了临床感染性疾病的精准诊断，在控制感染和疾病暴发方面效果明显。但由于NGS设备成本高昂、体积大，操作维护复杂，在临床微生物学实验室的应用受到限制，此外由于NGS读长相对较短，在病原微生物检测中一般采用单端75 bp测序方案，因此序列特异性相对较低，且NGS设备单次运行时间目前约需10 h，已相对稳定，因此检测时间难以进一步缩短［11］。而具有边解链边测序特性和长读长特点的纳米孔测序技术能很好解决这些问题。

纳米孔测序的原理及主要亮点

虽然早在1980年就出现了纳米孔测序技术的概念，但直到2014年才出现第1个实用化的纳米测序技术产品，由牛津纳米孔技术公司推出的MinION纳米测序仪，体积只有60 cm 重量只有90 g，可以通过USB接口与控制计算机连接并受其控制［12］。MinION纳米测序仪主要由运动蛋白、通道蛋白、特定的集成电路板组成。在运动蛋白作用下双链DNA（或RNA-DNA双链）分子被解开，单链的DNA或RNA通过通道蛋白会引起特征性的电流变化，而不同的电流变化对应的碱基序列不同，集成电路板能测量电流变化并转换输出成fastq格式序列文件，从而被特定的软件识别分析［13］。纳米孔测序主要有以下几方面的优势：（1）检测速度快：在感染性疾病中，纳米孔测序平台进行扩增子测序能够在10 min确定病原体，其快速实时检测病原体的优势得到了充分发挥，此外其对于快速准确检测细菌、真菌耐药基因及点突变也具有优势［13］。（2）实时测序：能够在测序开始后持续获得测序结果，结合同时开展的快速分析，能够极大缩短病原体检测时间，这些优势促使了纳米孔测序仪在基础研究和现场测序中得到了广泛应用。（3）长读取长度：读段长度范围在数百bp到数Mb之间，因此为在鉴别病原体的同时也为有效检测细菌耐药基因、毒力基因等提供了可靠依据。（4）原生单分子检测：能够在单分子水平上实现DNA/RNA及修饰的直接检测，直接组装RNA病毒基因组。（5）MinION纳米测序仪体积小、携带方便、单次运行成本低，便于临床检验实验室使用。

纳米孔测序在BSI病原体检测中的应用现状

应用纳米孔测序快速检测BSI病原体 因为纳米孔测序可以实时产出数据，所以搭配实时病原识别软件后，即可对实时获得的序列进行分析从而快速解析样本中的病原信息。納米孔测序技术实用化后，即被尝试应用于BSI病原快速检测，显示了实时测序所带来的时效性优势。2015年，Greninger等［14］首次使用MinION纳米孔测序仪和新开发的实时生物学分析管道MatePORE在6 h内完成了4份病毒感染患者血液样本的核酸提取到病原体鉴定。在107～108 copies/ml的滴度下，来自2例急性出血热患者的埃博拉病毒读数和来自1名无症状献血者的基孔肯雅病毒读数在数据采集的4～10 min内被检测出来，而较低滴度的丙型肝炎病毒（1×105 copies/ml）在40 min内被检测出来。这项研究首次展示了纳米孔测序在BSI病原快速检测中潜在的优势。

此后，更多研究者对纳米孔测序检测各类BSI病原的时效性和准确性进行了深入验证。2018年，Ashikawa等［15］使用MinION平台对血培养获得的细菌、真菌进行了16SrRNA基因和ITS序列扩增检测，在测序10 min后即可鉴定病原菌。与MALDI-TOF MS质谱检测结果比对显示，除了2种细菌由于16SrRNA测序的局限被错误鉴定，其余检测到的细菌和真菌同MALDI-TOF MS质谱分析的结果一致。和一代测序对比，其20个标本在测序10 min时的平均序列一致性高达99.03%。这项研究证明了纳米孔测序在检测导致BSI的临床常见细菌和真菌时的准确性。

同时，纳米孔测序检测也被尝试应用于指导常规方法难以诊断的罕见病原感染的临床治疗。2019年，Bialasiewicz等［16］报道，1例62岁的女性患者，在被狗咬伤后的第6天因为脓毒症休克和多器官功能衰竭收入重症监护病房，根据其被狗咬伤的病史和中性粒细胞中棒状包裹体的显微外观，怀疑是细菌病因导致的BSI，但作为金标准的血培养法3 d依然是阴性结果，随后使用MinION平台对患者的血液样本进行强化检测，在19 h后就确定了病原菌是犬嗜二氧化碳嗜血杆菌，而检测出的弓形虫考虑污染所致。该患者最初接受了哌拉西林-他唑巴坦、林可霉素和多西环素的治疗，随后根据MinION检测的阳性结果，调整后续14 d的用药为美罗培南，并在使用美罗培南3 d后病情好转，转出重症监护病房，随后顺利出院。犬嗜二氧化碳嗜血杆菌是BSI罕见的病原体，该案例提示纳米孔实时检测使快速确定罕见、血培养阴性的病原体成为可能，在改善诊断流程，优化临床抗菌药物的使用以及降低BSI患者的病死率、改善预后等方面具有巨大潜能。

应用纳米孔测序检测BSI病原体及其耐药性和毒力特征 除实时获取数据外，纳米孔测序还具有长读长的特点，因此相对于短读长的NGS，在完整基因序列的获取和分析中更具优势，能够从临床样本中直接获得更为完整的耐药基因、毒力基因等序列，为临床治疗提供更丰富的信息。Sakai等［17］较为系统地评价了纳米孔测序在血液样本中直接检测导致BSI的细菌及其耐药基因中的效果。使用MinION测序仪及对38个阳性血培养瓶中的样本进行了纳米孔测序，使用WIMP软件检测病原，ARMA软件检测耐药基因，并依据培养获得菌株的16SrRNA测序、MALdI-ToF MS质谱分析和药敏鉴定结果进行比较验证。纳米孔测序30 min获得的序列分析结果显示，18份革兰阴性细菌感染样本均被正确鉴定，但对于20份革兰阳性菌感染样本，由于受人源化核酸背景干扰，被鉴定为病原的序列读段比例较低，革兰阳性菌感染样本鉴定的正确率仅有60%，提示需优化革兰阳性菌的核酸提取方法。此外，在2份样本中检测到超广谱β内酰胺酶基因，与基因PCR扩增和药敏试验结果一致，但对四环素、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测结果与药敏表型并不相符。

Zhou等［18］使用MinION测序仪，在2 h内实现了对含有高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌样本进行宏基因组测序分析；其中3个样本为混入肺炎克雷伯菌的模拟BSI样本，细菌浓度是30 CFU/ml（样本1），将10 ml的模拟血样分别加入到厌氧血培养瓶（样本2）和需氧血培养瓶（样本3）中培养直到阳性，并以纯菌落作为对照（样本4）。在使用MinION测序2 h后对1～3号样本都实现检出，并检测到了20余条支持耐药基因和毒力基因鉴定的读段；测序20 h后，对样本2～4的耐药基因检出率达到了82.4%，该研究中毒力基因检出率更是高达96.1%。

值得注意的是，部分研究中使用的是基于网络的免费开放软件WIMP，与不同数据库比对就能自动识别细菌种类并预测对抗菌药物的敏感性，整个检测过程可以用1个由笔记本计算机控制的便携式设备进行，初始成本低，适用于不同层级的医疗机构，具有很强的普适性。早期明确感染病原的耐药性和毒力，对于降低BSI发病率、病死率，缩短住院时长，降低住院费用，减少国家医疗财政支出具有重要作用。以上结果显示纳米孔测序在BSI病原检测中能够具有较好的辅助临床诊疗效果和较高的卫生经济学效益，但仍需在實验技术和结果解读中进行更进一步优化。

应用纳米孔测序精确分析BSI病原基因组特征 通过纳米孔测序获得长读长序列，进而进行病原基因组组装，能够获得BSI感染病原体的完整基因组，这对明确病原基因组特征、更好识别耐药基因、毒力基因及其所在的基因环境具有重要意义。Zheng等［19］从BSI患者血液中培养得到1株多重耐药的大肠埃希菌2D菌株，该菌株具有对氨基糖苷类、第3代头孢菌素类、碳青霉烯类、喹诺酮类和四环素类药物的多药耐药特性。该研究采用MinION和Illumina测序平台进行了全基因组测序，发现该菌株拥有6个耐药基因，最具特点的是此菌株的耐药基因blaNDM-5位于质粒上，blaCTX-M-14同时存在染色体和质粒中；测序结果解释了细菌耐药性产生的分子机制，并通过基因组分析揭示了该菌的耐药性动态变化过程。除了耐药基因，明确病原体编码毒力基因的基因元件序列特点也具有重要的公共卫生意义。Gu等［20］在全基因组水平对耐碳青霉烯类药物的高毒力肺炎克雷伯菌进行了流行病学研究，表明经典的ST11型肺炎克雷伯菌在获得了1个约170 kbp的毒力质粒后，具有了高致病性、多重耐药性和高传播力的特性，引起了经呼吸道传播的医院获得性肺炎暴发，从分子水平上揭示了该菌株的高毒力和高耐药的产生机制。

以上研究显示了纳米孔测序技术在BSI病原基因组测序、耐药和毒力分子机制研究等方面的前沿应用，同时展示出了该技术在临床病原体监测、指导临床实践、促进公共健康方面的广阔应用前景。

不足和展望

纳米孔测序技术及平台具有以上优势，但依然存在以下不足：（1）当前测序错误率（6%～15%）仍然显著高于NGS平台（0.1%～1%）；（2）文库构建（在核苷酸片段两端连接上特定序列的接头，让文库在测序平台上进行测序）需要的样本核酸投入量较大，限制了对部分临床样本的直接测序［13］；（3）在相同测序数据量下，纳米孔宏基因组测序的病原基因组覆盖率通常较低［17］；（4）尽管纳米孔测序单次运行成本低，但由于单次测序通量较NGS偏低，目前和NGS相比在获得相同数据量时运行成本更高，限制了纳米孔测序的广泛使用。

错误率高是纳米孔测序的突出问题，可能导致将测序读段错误识别为基因组序列相似的病原体［17］，不过随着纳米孔测序技术的更新，测序准确率正在得到不断提高，例如近期牛津纳米孔技术公司推出的R10.4纳米孔和Kit12试剂盒，其原始读长准确度可超过99%，并且还可以根据需求选择不同的碱基识别方式——快速模式、高精度识别模式、超高精度识别模式，从而获得最高的准确度。在文库构建核酸投入量问题上，可以联合PCR技术，对样本扩增产物进行测序分析，如Ashikawa等［15］在研究中使用了PCR扩增，并预先使用了QIAamp PowerFecal DNA试剂盒，结合磁珠纯化系统预处理，提取和纯化DNA，进而很好地解决了病原体核酸量少以及PCR抑制剂的问题。

目前以牛津纳米孔平台为代表的纳米孔测序技术依然是此领域主导产品，我国也已经在自主研发纳米孔测序技术领域取得重大突破。2021年12月10日，中国成都齐碳科技有限公司发布了我国自主研发的量产纳米孔单分子基因测序仪、配套芯片和试剂公告。从成本上分析，随着纳米测序技术的进一步成熟及纳米孔测序技术国产化平台的推出，单次测序成本能得到显著下降［21］。

纳米孔测序技术快速检测病原体的能力已在实验研究中得到证实，但由于纳米孔测序技术在临床实际应用时间较短，目前积累临床测序原始样本仍较少，其临床实际应用效果还有待进一步验证。相信随着相关技术的不断革新完善，纳米孔测序有望成为一种可靠的临床常规使用病原学检测方法，改变感染性疾病的诊断和治疗实践。

参 考 文 献

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（收稿日期：2022-03-21）

基金项目：清华大学精准医学科研计划（QT201901）和北京市自然科学基金‐海淀原始创新联合基金（前沿项目）（L192069）