褪黑素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制

郑君毅，李晓凤，郭绪昆

心肌梗死是临床常见病，具有很高的发病率和病死率。尽早恢复缺血区域血流，减少心肌细胞死亡是最行之有效的方法，但血流恢复可引起缺血再灌注损伤（ischemic reperfusion injury，IRI），这也是亟需解决的问题。褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是一种主要由松果体产生的高度保守的分子，除了具有激素功能外，还参与机体多种系统的调控。褪黑素具有高度的亲脂性，可以自由穿过细胞膜，在心肌细胞内发挥抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，保护心肌细胞［1-2］。叉头盒O亚型（FOXO）是一个转录因子蛋白家族，在进化上高度保守，包括FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6［3］。FOXO4 是FOXO 家族重要的成员，广泛参与多种生理过程，如细胞增殖、分化、氧化应激反应和凋亡等。已有研究表明，FOXO4是蛋白激酶B（Akt）通路的下游分子，参与缺血性疾病的发生发展［4］。FOXO4可以特异性结合B细胞淋巴瘤2样11蛋白（BIM）启动子，促进其转录，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。但Akt/FOXO4/BIM 通路是否参与褪黑素对心肌细胞IR损伤的保护作用，目前少见报道。本实验旨在建立大鼠心肌细胞IRI模型，基于Akt/FOXO4/BIM信号通路探讨褪黑素对心肌细胞保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 凋亡试剂盒购自万类公司，兔源FOXO4、p-FOXO4、p-Akt、Akt 和BIM 一抗均购自CST 公司，小鼠源GAPDH 一抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔和羊抗小鼠二抗购自Proteinteck 公司，ECL 化学发光试剂盒购自Millipore 公司。Akt 抑制剂MK2206 购自Selleck 生物公司。细胞培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、青/链霉素、无糖DMEM培养液、TRIzol试剂购自赛默飞公司。MTT细胞增殖检测试剂盒和褪黑素购自Sigma-Aldrich 公司。LDH 检测试剂盒、RIPA、5×loading buffer、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自索莱宝公司。SYBR Green 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒购自罗氏公司；IL-6、TNF-α、MCP-1和GAPDH 引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。1～3 日龄的新生SPF 级C57L/6 小鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。

1.2 缺血再灌注模型的制作和分组 C57BL/6 新生小鼠40只，无菌条件下开胸取出心脏，PBS 冲洗以完全去除血迹。将心肌充分剪碎，加入0.08%胰蛋白酶和0.05%Ⅰ型胶原酶溶液，采用酶消化法提取小鼠原代心肌细胞［5］。将细胞分为正常对照组（CTRL 组，细胞在正常培养液中培养，不进行任何处理）；IRI 组：在实验前将细胞培养液换为不含FBS 的DMEM 培养液，在缺氧培养箱（95%N2、5%CO2）中处理45 min后取出细胞，补充20%FBS后在正常培养条件下培养6 h；褪黑素组（IRI+MEL 组）：在IRI 实验前12 h 加入褪黑素溶液（终浓度5 μmol/L），37 ℃培养12 h 后进行IRI 实验；Akt抑制剂组（IRI+MEL+MK2206 组）：在褪黑素溶液加入前2 h加入MK2206（终浓度10 μmol/L），37 ℃培养2 h 后加入褪黑素继续培养12 h，然后进行IR实验。

1.3 细胞存活率检测 各组实验结束后，每孔加入MTT 溶液（5 g/L，pH=7.4）20 μL，37 ℃继续孵育4 h，吸弃孔内上清液。每孔加150 μL二甲基亚砜（DMSO），室温下置于水平摇床上至结晶完全溶解。用酶标仪测定溶解液在490 nm波长处的吸光度（A）值。以CTRL 组的细胞存活率为100%，实验组细胞存活率（%）=实验组A值/CTRL组A值×100%。

1.4 细胞上清液LDH 含量检测 实验结束后，将细胞培养板用离心机400×g离心5 min。分别取各孔上清液120 μL，加入到新的96 孔板中。根据LDH 检测试剂盒说明书，各孔分别加入60 μL 新鲜配制的LDH 检测工作液，充分混匀，用铝箔包裹后置于水平摇床上缓慢摇动，室温孵育30 min 后，用酶标仪测定混合液在490 nm波长处A值，并计算各组LDH释放量。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 根据凋亡试剂盒说明书，在实验结束后，收集各组细胞上清液，用PBS 清洗细胞并收集清洗液。胰蛋白酶消化各组细胞后，将收集到的细胞上清液、PBS清洗液和细胞消化液合并，以1 000 r/min离心10 min以获得细胞沉淀。用PBS洗涤细胞2次，弃掉上清液，将细胞沉淀重悬于500 μL 结合缓冲液中，并与5 μL 膜联蛋白VFITC和10 μL碘化丙啶（PI）在室温下避光孵育15 min。通过流式细胞仪测定各组的细胞凋亡率。

1.6 qRT-PCR检测炎性因子基因表达 实验结束后弃掉细胞培养液，TRIzol 法提取细胞RNA。取2 μg 总RNA，逆转录成cDNA。采用qRT-PCR 法，取0.5 μL cDNA，使用SYBR Green qPCR 试剂盒扩增靶基因白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和GAPDH。所用引物见表1。PCR 反应条件：94 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，62 ℃退火/延伸30 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算各个靶基因的相对表达水平。

Tab.1 The primer sequences used for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列表

1.7 Western blot 法检测蛋白表达 各组细胞总蛋白用含1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液提取，使用5×loading buffer 变性总蛋白。取20 μg 变性总蛋白进行SDSPAGE，电泳后将凝胶在4 ℃、110 V 条件下转膜90 min。用5%脱脂奶粉室温封闭PVDF 膜2 h 后，切取包含p-Akt、Akt、p-FOXO4、FOXO4、BIM、GAPDH 蛋白条带的PVDF 膜，分别加入抗p-Akt、Akt、p-FOXO4、FOXO4、BIM（1∶1 000）或GAPDH（1∶10 000）抗体4 ℃孵育过夜。第2 天用TBST 洗膜后，加入1∶10 000稀释的HRP标记二抗，室温孵育1 h。再次用TBST 洗膜，在含有靶蛋白的PVDF 膜上滴加1 mL ECL 化学发光液反应1 min 后，在凝胶成像仪上曝光并分析蛋白表达水平。

1.8 统计学方法 应用SPSS 11.5 软件处理数据，符合正态分布的计量资料以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞存活率和LDH释放量比较 与CTRL组比较，IRI 组细胞存活率降低，LDH 释放量升高（P＜0.05）。与IRI 组比较，IRI+MEL 组细胞存活率升高，LDH 释放量降低（P＜0.05）；与IRI+MEL 组比较，IRI+MEL+MK2206组细胞存活率降低，LDH释放量升高（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表2 各组细胞存活率和LDH释放量比较（n=6，）

Tab.2 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表2 各组细胞存活率和LDH释放量比较（n=6，）

＊P＜0.05；a与CTRL 组比较，b与IRI 组比较，c与IRI+MEL 组比较，P＜0.05；表3—5同。

?

2.2 各组细胞凋亡率比较 与CTRL组比较，IRI组细胞早期和总凋亡率升高（P＜0.05）。与IRI 组比较，IRI+MEL 组细胞早期和总凋亡率降低（P＜0.05）；与IRI+MEL 组比较，IRI+MEL+MK2206 组细胞早期和总凋亡率升高（P＜0.05）。各组细胞晚期凋亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图1、表3。

Fig.1 Flow cytometry assay of cell apoptosis图1 流式细胞术检测细胞凋亡情况

Tab.3 Comparison of cell apoptosis between the four groups表3 各组细胞凋亡率比较（n=3，%，）

Tab.3 Comparison of cell apoptosis between the four groups表3 各组细胞凋亡率比较（n=3，%，）

?

2.3 各组细胞炎性因子基因表达水平比较 与CTRL 组比较，IRI 组IL-6、TNF-α 和MCP-1 基因相对表达水平升高（P＜0.05）。与IRI 组比较，IRI+MEL组IL-6、TNF-α和MCP-1基因相对表达水平降低（P＜0.05）；与IRI+MEL 组比较，IRI+MEL+MK2206 组IL-6、TNF-α 和MCP-1 基因相对表达水平升高（P＜0.05），见表4。

Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine gene expression levels between the four groups表4 各组细胞炎性因子基因表达水平比较（n=3，）

Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine gene expression levels between the four groups表4 各组细胞炎性因子基因表达水平比较（n=3，）

?

2.4 各组蛋白表达水平比较 与CTRL组比较，IRI组p-AKT蛋白表达水平降低，p-FOXO4和BIM蛋白表达水平升高（P＜0.05），与IRI组比较，IRI+MEL组p-AKT蛋白表达水平升高，p-FOXO4和BIM蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与IRI+MEL 组比较，IRI+MEL+MK2206 组p-AKT 蛋白表达水平降低，p-FOXO4 和BIM 蛋白表达水平升高（P＜0.05），见图2、表5。

Fig.2 Western blot assay of p-AKT,p-FOXO4 and BIM proteins图2 Western blot检测各组细胞p-AKT、p-FOXO4和BIM蛋白表达水平

Tab.5 Comparison of p-AKT,p-FOXO4 and BIM proteins between four groups表5 各组细胞p-AKT、p-FOXO4和BIM蛋白表达水平（n=3，）

Tab.5 Comparison of p-AKT,p-FOXO4 and BIM proteins between four groups表5 各组细胞p-AKT、p-FOXO4和BIM蛋白表达水平（n=3，）

?

3 讨论

研究表明，褪黑素对缺血再灌注损伤的心肌细胞具有保护作用［6］。褪黑素不仅可以通过激活沉默信息调节因子（SIRT3）信号通路减轻老年雄性大鼠心肌细胞的氧化应激和凋亡，改善缺血再灌注后心脏收缩功能，减少梗死面积［6］；还可以膜受体依赖的方式调控Notch1/Hes1/Akt 信号通路，恢复硫氧还蛋白系统，保护大鼠急性高血糖状态下缺血再灌注损伤时的心脏［7］。对接受心脏搭桥手术的患者使用褪黑素，可以减轻心肌细胞炎症、氧化应激和凋亡的程度，增加射血分数和减慢心率［8］。Zhang 等［9］研究结果证实褪黑素可以减轻IRI 心肌细胞凋亡和炎症反应，这与本研究结果一致。虽然本研究在体外心肌细胞的培养和IRI模型的制作上与Zhang等［9］并不完全相同，但是都证实了褪黑素在IRI心肌细胞中的抗凋亡和抗炎作用。在机制上，与Zhang等［9］通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路研究褪黑素心肌细胞保护作用不同，笔者研究了褪黑素对Akt/FOXO4/BIM信号通路的作用。

Akt信号通路在调节细胞生长、增殖和在生理和病理生理条件下的存活方面发挥着核心作用［10］。FOXO4 是Akt 通路重要的下游分子，主要通过调控转录及信号转导途径，影响机体生理调节、应激反应、代谢、细胞凋亡和自噬等方面［11-12］。研究表明，FOXO4 在缺血再灌注引起细胞损伤中具有重要的作用［13-14］。IRI 时，FOXO4 转移到细胞核，发挥其转录因子功能，促进环磷酸腺苷（cAMP）转录，抑制缺氧诱导因子1α（HIF1α），激活纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）；FOXO4还可诱导肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体（TRAIL）、Fas 细胞表面死亡受体配体（FasL）和BIM 等促凋亡信号通路的激活［13］，参与IRI。FOXO4 与凋亡家族蛋白BIM、B 淋巴细胞瘤-6（Bcl-6）等促凋亡蛋白的启动子特异性结合，促进其转录，从而抑制B 淋巴细胞瘤-XL（Bcl-XL）等抗凋亡蛋白的转录，负性调节细胞增殖。以上研究提示，FOXO4 参与IRI，但FOXO4 是否参与褪黑素对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用，目前尚少见报道。

Akt/FOXO4/BIM信号通路在细胞凋亡中具有重要作用［15］。BIM 是仅含一个BH3 结构域的Bcl-2 蛋白家族促凋亡成员，可以与Bcl-2 家族所有的促生存蛋白结合，是一种重要的促凋亡分子。FOXO4通过与BIM 启动子特异性结合，调节BIM 转录水平。Wang 等［15］研究发现，过表达FOXO4 能通过上调BIM 的表达来促进肾脏透明细胞癌的细胞凋亡，敲低BIM 能够阻断FOXO4 的促凋亡作用。这种FOXO4 依赖的BIM 促凋亡活性受到Akt 活性的调控。Lv 等［16］在人的MCF7 乳腺癌细胞系中发现，当Akt活化时，可以抑制FOXO4的转录，进而抑制BIM的转录；而PI3K抑制剂能够促进FOXO4和BIM的转录，BIM 通过与抗凋亡蛋白相互作用，释放Bax 和Bak诱导细胞凋亡。虽然本研究与Lv等［16］的研究采用不同的疾病模型，但是与其研究结果相似的是，本研究也发现褪黑素调控的Akt磷酸化水平升高通过抑制p-FOXO4 和BIM 蛋白表达，进而减少IRI 引起的细胞凋亡。

本研究初步探索了缺血再灌注损伤中褪黑素的保护机制，但褪黑素是如何调控Akt的磷酸化水平，是通过何种受体激活Akt/FOXO4/BIM 信号通路，还有待后期进一步深入研究，以期为褪黑素治疗心肌梗死提供新的治疗靶点和理论依据。