miR-338-5p通过靶向TSHZ3促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭

刘宏伟，朱奕，向玲宝，熊洪，陈瑞琦

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，具有较高的病死率和复发率。然而，膀胱癌缺乏可靠的肿瘤标志物，并且其进展的分子机制尚未完全阐明。目前已发现大量miRNA在膀胱癌中表达失调，影响肿瘤增殖、侵袭、血管生成等过程，其有成为膀胱癌早期诊断标志物的巨大潜力［1］。研究表明，miR-338-5p 在人类多种癌症中表达失调［2-4］。然而，miR-338-5p 在膀胱癌中的作用和机制尚未阐明。本研究通过检测miR-338-5p在膀胱癌中的表达，并通过细胞实验阐明miR-338-5p在膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1 和人膀胱癌细胞T24 和UM-UC-3 均购自中国科学院上海细胞库。miR-338-5p mimics和miR-338-5p inhibitor购自苏州吉玛基因股份有限公司；TSHZ3过表达质粒（以GV712为载体）购自上海吉凯基因有限公司；F-12K、RPMI-1640 和DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；胎牛血清购自北京全式金生物技术有限公司；Lipofectamine RNAimax 转染试剂和Trizol 试剂购自美国Invitrogon公司；X-tremeGENE HP DNA转染试剂购自Roche公司；CCK-8试剂购自日本同仁公司；Transwell小室购自美国BD 公司；PrimeScript 反转录试剂盒和TB Green premix Ex Taq 试剂盒购自TaKaRa 公司；miRNA 荧光定量PCR试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翌圣生物科技股份有限公司；SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TSHZ3、Wnt3a、β-catenin、GAPDH 和β-actin抗体购自美国proteintech公司。

1.2 组织标本 收集2019 年9 月—2022 年9 月在广东医科大学附属医院行根治性膀胱切除术的33例膀胱癌患者的癌组织和癌旁组织。组织标本取出后立即置于液氮中保存，所有癌组织均经病理医师诊断为膀胱尿路上皮癌。患者均签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和转染 SV-HUC-1 细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的F-12K培养基中培养，T24细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中培养，UM-UC-3细胞在DMEM培养基中培养，放置于5%CO2、37 ℃的恒温培养箱内。转染时，提前将2×105个T24 细胞或1.5×105个UM-UC-3 细胞接种至6 孔板内，按照转染试剂说明书将miR-338-5p mimics、miR-338-5p inhibitor、TSHZ3 过表达质粒和各自的对照组（mimics-NC、inhibitor-NC、vector）分别转染至T24和UM-UC-3细胞中，于培养箱内培养6 h后更换为完全培养基继续培养。

1.3.2 RNA 提取和qRT-PCR 将SV-HUC-1、T24 和UMUC-3细胞接种至6孔板内，待细胞处于对数生长期提取各细胞系的RNA。T24 和UM-UC-3 细胞转染24 h 后，收集各组细胞，提取RNA。分别将膀胱癌组织和癌旁组织研磨，提取RNA。将以上提取的RNA测定浓度，按照反转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA，miRNA 的反转录采用加尾法。miR-338-5p 引物：上游5'-ACGGTACTAACAATATCCTGG-3'，下游引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。内参采用U6，U6引物：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH 引物：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 个循环。结果采用2-ΔΔCt计算各基因相对表达量。

1.3.3 CCK-8 实验 将转染后处于对数生长期的T24 和UM-UC-3 细胞分别接种至96 孔板内，每孔1 000 个细胞，每组设置4个复孔。分别在第1、2、3、4、5天同一时间向每孔加入10 μL CCK-8 试剂，继续在培养箱内孵育2 h。在酶标仪450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，并绘制细胞增殖曲线。

1.3.4 Transwell 迁移实验 收集转染24 h 后处于对数生长期的各组细胞，离心后用无血清培养基将细胞沉淀重悬为单个细胞并计数。在24孔板下室加入600 μL血清含量为20%的完全培养基，将Transwell 小室置于24孔内，在小室内加入200 μL 含8×104个细胞的重悬液，置于培养箱内继续培养18 h 后取出，采用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，待小室干燥后在显微镜下随机读取3个视野拍照并计数。

1.3.5 Transwell侵袭实验 提前将冻存于-20 ℃的基质胶置于4 ℃解冻。次日，按照基质胶和无血清培养基1∶5 的体积比配成稀释液，Transwell 小室置于24 孔板内，吸取50 μL 的基质胶稀释液铺于小室内，然后将24 孔板置于37 ℃培养箱内2～3 h使基质胶稀释液凝固，后续实验步骤同Transwell迁移实验。

1.3.6 双萤光素酶报告基因实验 采用TargetScan、miRDB和Targetminer 数据库预测miR-338-5p 潜在的靶基因，选定靶基因TSHZ3。构建miR-338-5p与TSHZ3的双萤光素酶报告基因载体，将含有与miR-338-5p结合位点的TSHZ3 3'-非翻译区（UTR）的野生型序列和突变型序列分别插入GPmiRGLO质粒中，构建TSHZ3野生型质粒（TSHZ3-wt）和突变型质粒（TSHZ3-mut）。然后将2 种质粒分别与miR-338-5p mimics共转染至膀胱癌细胞中。24 h后收集细胞，按照说明书操作要求，使用带有化学发光检测的酶标仪检测萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的发光信号强度，根据测得值进行统计分析。

1.3.7 Western blot 实验 收集转染后48 h 的细胞并提取各组总蛋白，测量蛋白浓度并加热变性。制备SDS-PAGE 凝胶，将30 μg总蛋白加入上样孔内，恒压电泳2 h，然后恒流转膜2 h，将蛋白转移至PVDF 膜。转膜后脱脂奶粉封闭1 h。在4 ℃条件下孵育一抗（TSHZ3、Wnt3a 抗体浓度为1∶1 000，β-catenin、GAPDH 和β-actin 抗体浓度为1∶10 000）过夜，次日孵育二抗1 h并进行化学反应曝光，使用Image J 软件进行灰度值分析。

1.4 统计学方法 上述实验均重复3 次。实验数据采用GraphPad Prism 8.0 作图，SPSS 21.0 进行数据分析，符合正态分布的计量数据以均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnett 法；2 组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-338-5p 在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达 miR-338-5p 在膀胱癌组织中的表达量高于癌旁组织（2.99±1.65vs. 1.29±0.22，n=33，t=5.220，P＜0.01）。

2.2 miR-338-5p 在正常输尿管上皮细胞和膀胱癌细胞中的表达 miR-338-5p 在膀胱癌T24 和UMUC-3 细胞中的表达高于其在输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1中的表达，见图1。

Fig.1 The expression of miR-338-5p in normal urothelial cells and bladder cancer cells图1 miR-338-5p在正常输尿管上皮细胞和膀胱癌细胞中的表达

2.3 过表达和敲低miR-338-5p的转染效率 膀胱癌T24 和UM-UC-3 细胞中miR-338-5p mimics 组miR-338-5p 的相对表达量是mimics-NC 组的（5.75±0.48）倍和（6.04±0.33）倍，见图2A。而转染miR-338-5p inhibitor 后，与inhibitor-NC 相比，miR-338-5p的表达水平下调，见图2B。

Fig.2 Transfection efficiency of overexpression and inhibition of miR-338-5p图2 过表达和敲低miR-338-5p的转染效率

2.4 过表达和敲低miR-338-5p对膀胱癌细胞增殖的影响 CCK-8结果显示，与mimics-NC组相比，过表达miR-338-5p后T24和UM-UC-3细胞的增殖能力提高；转染miR-338-5p inhibitor 后细胞的增殖能力下降（P＜0.05）。见图3、4。

Fig.3 Effect of overexpression of miR-338-5p on cell proliferation detected by CCK-8 assay图3 CCK-8检测过表达miR-338-5p对细胞增殖的影响

Fig.4 Effect of inhibition of miR-338-5p on cell proliferation detected by CCK-8 assay图4 CCK-8检测抑制miR-338-5p表达对细胞增殖的影响

2.5 过表达和敲低miR-338-5p对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响 Transwell 迁移和侵袭实验结果显示，miR-338-5p mimics组膀胱癌细胞的迁移和侵袭细胞数均高于mimics-NC 组；转染miR-338-5p inhibitor 后膀胱癌细胞的迁移和侵袭细胞数较inhibitor-NC组减少（P＜0.05）。见表1，图5、6。

Tab.1 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the four groups表1 各组迁移和侵袭细胞数比较（n=3，个/视野，）

Tab.1 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the four groups表1 各组迁移和侵袭细胞数比较（n=3，个/视野，）

＊＊P＜0.01。

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Fig.5 Effects of overexpression of miR-338-5p on migration and invasion of bladder cancer cells(crystal violet staining,×200)图5 过表达miR-338-5p对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色，×200）

Fig.6 Effects of inhibition of miR-338-5p on migration and invasion of bladder cancer cells(crystal violet staining,×200)图6 抑制miR-338-5p表达对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色，×200）

2.6 miR-338-5p 与TSHZ3 3'-UTR 的潜在结合位点 筛选出TSHZ3 可能为miR-338-5p 的潜在靶基因。TargetScan 预测miR-338-5p 与靶基因TSHZ3的3'-UTR的结合位点，见图7。

Fig.7 Nucleotide sequences complementary to miR-338-5p in the 3'-UTR of TSHZ3图7 TSHZ3的3'-UTR与miR-338-5p互补的核苷酸序列

2.7 miR-338-5p 对TSHZ3 的靶向调控作用 将构建的TSHZ3-wt 和TSHZ3-mut 分别与miR-338-5p mimics 共转染T24 和UM-UC-3 细胞。双萤光素酶报告基因结果显示，miR-338-5p mimics能够降低野生型TSHZ3质粒的萤光素酶活性（P＜0.05），然而不能降低突变型TSHZ3 质粒的萤光素酶活性（P＞0.05），见表2。过表达miR-338-5p可降低膀胱癌细胞中TSHZ3 mRNA和蛋白水平，见图8、9。

Tab.2 Comparison of the luciferase activity between the two groups表2 各组萤光素酶活性比较 （n=3，）

Tab.2 Comparison of the luciferase activity between the two groups表2 各组萤光素酶活性比较 （n=3，）

＊＊P＜0.01。

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Fig.8 Effect of overexpression of miR-338-5p on TSHZ3 mRNA expression图8 过表达miR-338-5p对TSHZ3 mRNA表达的影响

Fig. 9 Effect of overexpression of miR-338-5p on TSHZ3 protein level图9 过表达miR-338-5p对TSHZ3蛋白水平的影响

2.8 过表达TSHZ3 减弱miR-338-5p 的促癌作用 细胞实验结果显示，与SV-HUC-1 细胞相比，T24 和UM-UC-3 细胞TSHZ3 mRNA 表达水平也显著降低（P＜0.05），见图10。功能挽救实验显示，相较于mimics-NC组，过表达miR-338-5p能够提高膀胱癌细胞的增殖能力，同时过表达TSHZ3 部分抵消了miR-338-5p 对膀胱癌细胞增殖的促进作用（P＜0.05），见图11。同时转染miR-338-5p mimics 和过表达TSHZ3 组细胞的迁移和侵袭能力较miR-338-5p mimics组明显降低（P＜0.05），见表3、图12。

Tab.3 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the three groups表3 各组迁移和侵袭细胞数比较（n=3，个/视野，）

Tab.3 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the three groups表3 各组迁移和侵袭细胞数比较（n=3，个/视野，）

＊＊P＜0.01；a 与mimics-NC 组比较，b 与miR-338-5p mimics 组比较，P＜0.05。

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Fig.10 The mRNA expression of TSHZ3 in normal urothelial cells andbladder cancer cells图10 TSHZ3 mRNA在正常输尿管上皮细胞和膀胱癌细胞中的表达

Fig.11 Cell viability detected by CCK-8 assay in each group图11 CCK-8检测各组细胞增殖活力

Fig.12 Migration and invasion of each group of cells(crystal violet staining,×200)图12 各组细胞迁移侵袭情况（结晶紫染色，×200）

2.9 过表达miR-338-5p对Wnt/β-catenin信号通路的影响 Western blot 结果表明，与mimics-NC 组相比，过表达miR-338-5p 增加膀胱癌UM-UC-3 细胞中Wnt3a（0.78±0.03vs.1.21±0.05，n=3，t=12.874，P＜0.01）和β-catenin（0.88±0.02vs. 1.25±0.06，n=3，t=10.979，P＜0.01）蛋白表达水平，见图13。

Fig.13 Effect of overexpression of miR-338-5p on the protein level of Wnt3a and β-catenin图13 过表达miR-338-5p对Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影响

2.10 过表达TSHZ3对Wnt/β-catenin信号通路的影响 在膀胱癌UM-UC-3 细胞中转染TSHZ3 过表达质粒，Western blot结果显示，与vector组相比，Wnt3a（0.82±0.05vs. 0.51±0.04，n=3，t=8.138，P＜0.01）和β-catenin（0.94±0.03vs.0.75±0.07，n=3，t=4.409，P＜0.05）蛋白水平降低，见图14。

Fig.14 Effect of overexpression of TSHZ3 on the protein level of Wnt3a and β-catenin图14 过表达TSHZ3对Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影响

3 讨论

膀胱癌与高龄、吸烟、接触化学致癌物、职业暴露和环境污染等多种因素相关，具有较高的复发率和进展率［5］。研究表明，癌基因的激活或者抑癌基因的失活与膀胱癌的发生及进展密切相关［6］。miRNA 是一种长度为20～22 个核苷酸的非编码RNA，其表达失调与恶性肿瘤的增殖、迁移、侵袭、凋亡和转移等生物学行为密切相关［7］。因此，阐明膀胱癌中关键miRNA的作用和机制，探索新的潜在诊断标志物和治疗靶点具有重要的临床意义。

3.1 miR-338-5p 在肿瘤中的表达及作用 研究表明，miR-338-5p在肺癌［2］、食管癌［8］和胃癌［9］中表达下调，在胶质瘤［3］、恶性黑色素瘤［10］、视网膜母细胞瘤［11］和结直肠癌［4］中表达上调。本研究首先检测了miR-338-5p 在膀胱癌中的表达，qRT-PCR 结果显示miR-338-5p 在膀胱癌中呈高表达。细胞功能实验表明过表达miR-338-5p 可促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭，敲低miR-338-5p 表达抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。TSHZ3 基因能够编码一种锌指转录因子，课题组前期研究证实TSHZ3 在膀胱癌中低表达并抑制细胞的增殖、迁移与侵袭［12］。通过生物信息学预测发现miR-338-5p 与TSHZ3 的3'-UTR 存在潜在结合位点。双萤光素酶报告基因实验显示，在膀胱癌细胞中，与mimics-NC+TSHZ3-wt 组相比，miR-338-5p mimics+TSHZ3-wt 组的萤光素酶活性下降。Western blot结果显示，过表达miR-338-5p可降低膀胱癌细胞中TSHZ3蛋白水平，表明miR-338-5p 对TSHZ3 具有靶向负调控作用。挽救实验表明，过表达TSHZ3 部分抵消了miR-338-5p对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用，提示miR-338-5p 通过抑制TSHZ3 的表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭。

3.2 miR-338-5p及TSHZ3对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用 研究表明，在人视网膜母细胞瘤Y79 细胞中转染miR-338-5p 模拟物，lncRNA MBNL1-AS1 对细胞增殖、迁移的抑制作用以及对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用减弱，说明miR-338-5p 通过调控Wnt/β-catenin 信号通路促进Y79细胞的增殖和迁移［11］。Yao 等［13］研究发现miR-338-5p能够通过调控Wnt8/β-catenin通路促进胰腺癌细胞的干性和进展。本研究证实，过表达miR-338-5p可上调膀胱癌UM-UC-3细胞内Wnt3a和βcatenin 蛋白表达水平，提示miR-338-5p 通过激活Wnt/β-catenin 信号通路促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究进一步探讨了miR-338-5p 下游靶基因TSHZ3 对Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的作用，结果显示过表达TSHZ3可抑制Wnt3a和βcatenin 蛋白表达，说明TSHZ3 在膀胱癌内发挥抑癌作用可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述，miR-338-5p 在膀胱癌中高表达，miR-338-5p 通过抑制TSHZ3 的表达促进膀胱癌的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与激活Wnt/βcatenin信号通路有关，这为miR-338-5p作为膀胱癌潜在治疗靶点提供了理论基础。