藜麦内生细菌LS3 发酵条件优化及其抑菌机制初探

秦 楠 ，任 璐 ，2，吕 红 ，殷 辉 ，赵晓军 ，2

（1.山西农业大学 植物保护学院，山西 太原 030031；2.农业农村部有机旱作农业重点实验室（省部共建），山西 太原 030031）

藜麦（Chenopodium quinoa）因其具有极高的营养价值在我国种植面积不断扩大，也伴随着大量病虫害的出现[1-2]。藜麦黑茎病是危害藜麦茎部的新病害，该病害的病原为Ascochyta caulina，为2017 年在山西忻州市静乐县首次发现，其病原为茎生壳二孢，典型症状是在茎上形成黑色坏死病斑，病斑可完全包裹茎，引起倒伏、籽粒空瘪和不育，最终造成藜麦损失巨大，甚至绝收[3]。

植物内生细菌是一类丰富的微生物资源，在作物保护方面发挥着重要的作用。其中，芽孢杆菌（Bacillusspp.）是对植物病害具有防治效果的有益微生物，其广泛存在于自然界，具有繁殖速度快、能产生抗逆性极强的芽孢以及抗菌谱广等优点。芽孢杆菌可在植物根际土壤、植物组织体内定殖，通过分泌抗菌物质、与病原菌竞争营养物质以及诱导宿主植物产生相关防御酶等方式达到防治植物病害的目的[4-6]。生防细菌的发酵过程受多种因素的影响，例如培养基配方对该菌的菌体量、生长速度以及对靶标菌的抑制效果等均有不同程度的影响，除此之外，相同属、种生防细菌的最适发酵条件可能因为其生理特性、对环境的偏好性而不同，发酵条件的优化有利于提高生防细菌的生防能力，为生防制剂的高效应用提供理论支持[7-9]。

芽孢杆菌是生防制剂的重要资源之一，在生物防治中得到广泛研究和应用[10]，目前关于芽孢杆菌发酵条件的研究已有较多报道，黎燕珊等[11]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌HC-8 发酵条件经过优化以后，其最适基础培养基为酵母蛋白胨培养基（YSP），最佳发酵条件为温度37 ℃，初始pH 值6.0，转速180 r/min，接种量0.1%，装液量20 mL/300 mL，发酵时间48 h，优化后的方案可显著提高HC-8 菌株的发酵产量；宋本超等[12]研究发现，解淀粉芽孢杆菌Z17-2 经一系列发酵条件优化后较优化前发酵液菌体量提升了120%，抑菌活性提高43.8%；刘仕飞等[13]研究发现，禾谷丝核菌生防细菌XZ18-3 采用单因素试验以及响应面法优化以后，抑菌率为57.3%，比原发酵液提高了56.6%。

本研究以分离得到生防细菌LS3 发酵液的OD600值和对A.caulina的抑菌率为指标，采用单因素及正交试验方法对LS3 菌株发酵液培养基进行筛选和发酵条件进行优化，以期为LS3 菌株后续作为生防菌制剂化商品的研究和应用提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 藜麦黑茎病病原菌（Ascochytacaulina），从山西省静乐县娑婆乡发病的藜麦植株上分离、纯化获得；拮抗细菌LS3，由山西农业大学植物保护学院果蔬病害课题组分离、纯化并保存。

1.1.2 供试培养基 LS3 菌株的培养采用NA 培养基（牛肉膏5.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 5.00 g、琼脂粉20.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 值调至7.4～7.6）和NB 培养基（牛肉膏5.00 g、蛋白胨10.00 g、葡萄糖20.00 g、氯化钠5.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL）。

发酵条件优化采用的基础培养基有BPY 培养基（蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、牛肉浸膏5.00 g、葡萄糖5.00 g、NaCl 5.00 g、蒸馏水1 000 mL），CM培养基（蛋白胨10.00 g、牛肉浸膏5.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL），LB 培养基（蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、NaCl 10.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL），NYBD 培养基（酵母浸膏5.00 g、牛肉浸膏8.00 g、葡萄糖10.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL），YSP 培养基（蛋白胨10.00 g、蔗糖20.00 g、酵母浸膏5.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL）。以上培养基pH 值均调至7.0。

LS3 菌株抑菌活性物质检测采用的鉴定培养基有酪蛋白培养基（琼脂粉1.50 g、脱脂奶粉5.00 g分别溶于100 mL 蒸馏水中，两液分开灭菌，待冷却至45～55 ℃时将二者充分混匀），几丁质培养基（甲壳素15.00 g、酵母粉5.00 g、（NH4）2SO41.00 g、MgSO4·5H2O 0.30 g、KH2PO41.36 g、琼脂15.00 g，蒸馏水定容至l 000 mL），茯苓粉培养基（K2HPO417.98 g、KH2PO46.80 g、茯苓粉4.00 g、酵母膏5.00 g、苯胺蓝100 mg、琼脂 20.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL），羧甲基纤维素（CMC）培养基（CMCNa 5.00 g、K2HPO40.25 g、（NH4）2SO40.50 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、琼脂20.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL）。

所有培养基均在121 ℃湿热灭菌后使用。

1.2 试验方法

1.2.1 LS3 种子液及发酵滤液的制备

1.2.1.1 LS3 种子液的制备 将4 ℃条件保存的LS3 菌株划线接种于NA 平板上，置于26 ℃培养箱活化24 h 后，挑取一环单菌落接种于NB 培养基中，于26 ℃、160 r/min 振荡培养24 h，得到LS3 种子液。

1.2.1.2 LS3 发酵滤液的制备 将LS3 的种子液按照1%（V/V）的接种量接入NB 培养基中，于26 ℃、160 r/min 振荡培养，在培养结束后，再于12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，将离心上清液置于20 mL 规格的注射器中，在注射器出口处安装0.22 μm 微孔滤膜，挤压注射器，使液体从微孔滤膜中缓缓流出，得到生防细菌的发酵滤液，即生防细菌代谢物，于4 ℃保存备用。

1.2.2 LS3 菌株发酵最佳培养基筛选 分别配制BPY、YSP、LB、NB、CM、NYBD 等6 种常用培养基，高压灭菌处理，冷却后将已摇好的LS3 种子液按1% 的接种量接入到上述6 种培养基中，于26 ℃、160 r/min 振荡培养72 h，以空白培养基作为对照，测定培养第24、48、72 小时的OD600值以及发酵终止后发酵滤液对A.caulina的抑菌率，从而确定最佳基础培养基。

1.2.3 LS3 菌株最佳碳源筛选 选取1.2.2 效果最佳的培养基作为基础培养基进行试验，分别用等量的可溶性淀粉、乳糖、甘露醇、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖取代基础培养基中的碳源，保持其余成分不变配制对应的培养基，高压灭菌处理以后，将已发酵完成的LS3 发酵液按1%的接种量接入到上述7 种培养基中，于26 ℃、160 r/min 振荡培养72 h。以不添加LS3 发酵液的培养基作为对照。测定培养第24、48、72 小时的OD600值以及发酵终止后发酵滤液对A.caulina的抑菌率，从而确定最佳碳源。

1.2.4 LS3 菌株最佳氮源筛选 将筛选出的培养基作为最佳培养基，将筛选出的碳源最为最佳碳源进行试验。分别用等量的蛋白胨、尿素、胰蛋白胨+牛肉膏、蛋白胨+牛肉膏、牛肉膏加酵母粉、蛋白胨+酵母粉、胰蛋白胨+酵母粉、牛肉膏+酵母粉+蛋白胨取代已筛出基础培养基中的氮源，保持其余成分不变配制对应的培养基，高压灭菌处理以后，将已发酵完成的LS3 发酵液按1%的接种量接入到上述8 种培养基中，于26 ℃、160 r/min 振荡培养72 h。以不添加LS3 发酵液的培养基作为对照。测定培养第24、48、72 小时的OD600值以及发酵终止后发酵滤液对A.caulina的抑菌率，从而确定最佳氮源。

1.2.5 LS3 菌株最佳发酵温度筛选 将筛选出的培养基作为最佳培养基，将筛选出的碳源作为最佳碳源，将筛选出的氮源作为最佳氮源进行试验。配制好培养基经过高压灭菌处理以后，将已发酵完成的LS3 发酵液按1%的接种量接入到上述培养基中，分别于35、30、28、26 ℃，转速保持160 r/min 不变振荡培养72 h。以不添加LS3 发酵液的培养基作为对照。测定培养第24、48、72 小时的OD600值以及发酵终止后发酵滤液对A.caulina的抑菌率，从而确定最佳发酵温度。

1.2.6 LS3 菌株发酵条件优化 将1.2.2 中筛选出的培养基作为最佳培养基，将1.2.3 中筛选出的碳源作为最佳碳源，将1.2.4 中筛选出的氮源作为最佳氮源，将1.2.5 中筛选出的温度作为最佳温度进行试验。使用正交试验L16（45）LS3 的发酵液转速、装液量、pH、发酵时间、接种量进行优化（表1）。每个不同处理重复2 次，测定培养第24、48、72 小时的OD600值以及发酵终止后发酵滤液对A.caulina的抑菌率，从而确定最佳发酵条件。

表 1 发酵条件正交试验设计Tab.1 Orthogonal experiment design of fermentation conditions

1.2.7 LS3 菌株抑菌相关酶活性测定

1.2.7.1 胞外蛋白酶活力 取5 g 脱脂奶粉制备蛋白培养基，将LS3 菌株点接于培养基中央，25 ℃恒温（光暗各12 h 交替）培养48 h，观察菌落周围有无透明圈产生[14]。

1.2.7.2 几丁质酶活力 称取2 g几丁质，加入10 mL丙酮研磨，研磨过程中缓慢加入适量丙酮，使用玻璃棒充分搅拌，直至其成糊状为止。在4 ℃条件下边搅拌边加入浓盐酸30 mL，继续用磁力搅拌器搅拌2 h，在4 ℃的冰箱静置24 h。将混合物加入到预冷的95%乙醇中，于4 ℃、5 000 r/min 进行离心，除去上清液，再加入预冷的无菌水离心，除去上清液，反复多次，直至上清液为中性为止。收集胶体几丁质沉淀，即制成胶体几丁质。将多余的胶体几丁质调整浓度为1%，避光保存于冰箱。只用胶体几丁质制成几丁质培养基，将LS3 菌株点接于几丁质培养基上，25 ℃恒温（光暗各12 h 交替）培养48 h，观察菌落周围有无透明圈产生[14]。

1.2.7.3 β-l，3-葡聚糖酶活力 取5 g 茯苓粉配制茯苓培养基，将LS3 菌株点接于培养基中央，25 ℃恒温（光暗各12 h 交替）培养48 h，观察菌落周围有无透明圈产生[14]。

1.2.7.4 纤维素酶（β-1，4-葡聚糖酶）活性 配制羧甲基纤维素培养基，将LS3 菌株点接于培养基中央，25 ℃恒温（光暗各12 h 交替）培养48 h，使用1 mg/mL 的刚果红染色30 min，然后用1 mol/L 的NaCl 浸泡20 min，使用无菌水冲洗掉表面附着的刚果红，观察菌落周围是否产生透明圈[14]。

1.3 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 25.0 进行数据统计分析；采用Duncan 氏新复极差法对试验数据进行分析，以P＜0.05 作为具有显著性差异的标准。

2 结果与分析

2.1 LS3 菌株发酵最佳培养基筛选

由图1 可知，LS3 在不同培养基生长过程中表现出差异，在YSP 培养基中OD600值最大，在NB培养基中OD600值最小；在发酵72 h 后不同培养基中菌体生长量大小依次为YSP＞BPY＞NYBD＞LB＞CM＞NB。

图1 不同基础培养基对菌株LS3 菌体生长量及代谢物抑菌活性的影响Fig.1 Effects of different culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

LS3 在不同培养基中发酵结束后对A.caulina的抑制效果也表现出差异，发酵滤液对A.caulina抑菌率最高的是YSP 培养基，抑菌率最低的是NB培养基；各培养基中发酵滤液对A.caulina的抑菌率大小依次为YSP（77.3%）＞NYBD（71.6%）＞BPY（70.7%）＞CM（69.6）＞LB（67.2%）＞NB（55.9%）。综合分析，LS3 在YSP 培养基中代谢产物累积量最多，对A.caulina的抑菌率也最高。因此，将YSP 培养基作为LS3 的最佳发酵培养基。

2.2 LS3 菌株最佳碳源筛选

图2 为LS3 菌株在不同碳源培养基中发酵24、48、72 h 时的OD600以及发酵结束后对LS3 发酵滤液对A.caulina的抑制效果，其中，LS3 在不同碳源培养基生长过程中表现出差异，在以葡萄糖为碳源的培养基中OD600值最大，在以可溶性淀粉为碳源的培养基中OD600值最小；在发酵72 h 后不同碳源培养基中菌体生长量大小依次为葡萄糖＞蔗糖＞甘露糖＞麦芽糖＞甘露醇＞乳糖＞可溶性淀粉。

图2 不同碳源培养基对菌株LS3 菌体生长量及代谢物抑菌活性的影响Fig.2 Effects of different carbon source culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

LS3 在不同碳源培养基中发酵结束后对A.caulina的抑制效果也表现出差异，发酵滤液对A.caulina抑菌率最高的是以蔗糖为碳源的培养基，抑菌率最低的是以可溶性淀粉为碳源的培养基，不同碳源培养基中发酵滤液对A.caulina抑菌率大小依次为蔗糖＞葡萄糖（72.0%）＞麦芽糖（71.1%）＞甘露醇（70.2%）＞甘露糖（69.4%）＞乳糖（47.9%）＞可溶性淀粉（5.5%）。综合分析，LS3 在以蔗糖为碳源的培养基中代谢产物累积量较多，对A.caulina的抑菌率也最高。因此，将蔗糖作为LS3 的最佳碳源。

2.3 LS3 菌株最佳氮源筛选

图3 为LS3 菌株在不同氮源培养基中生长第24、48、72 h 下的菌体数量以及在72 h 下LS3 代谢产物对A.caulina的抑制率，细菌随着时间的生长在不同氮源培养基中出现明显差异，其中，在以牛肉膏+酵母粉为氮源的培养基细菌数量最多，在以尿素为氮源的培养基中细菌数量最少；不同氮源培养基中LS3 菌体数量大小依次为牛肉膏+酵母粉＞牛肉膏+酵母粉+蛋白胨＞牛肉膏+蛋白胨＞蛋白胨+酵母粉＞蛋白胨＞胰蛋白胨+酵母粉＞牛肉膏+胰蛋白胨＞尿素。

图3 氮源培养基对菌株LS3 菌体生长量及代谢物抑菌活性的影响Fig.3 Effects of different nitrogen source culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

在不同氮源培养基中发酵72 h 以后，代谢产物对A.caulina的抑制率也出现明显差异，在以牛肉膏+酵母粉为氮源的培养基中的代谢产物对A.caulina的抑菌率最高，在以尿素为氮源的培养基中的代谢产物抑菌率最低；不同氮源培养基中代谢产物对A.caulina的抑制率大小依次为牛肉膏+酵母粉（73.33%）＞牛肉膏+酵母粉+蛋白胨（73.1%）＞牛肉膏+蛋白胨（72.0%）＞蛋白胨+酵母粉（71.6%）＞胰蛋白胨+酵母粉（70.8%）＞牛肉膏+胰蛋白胨（68.7%）＞蛋白胨（66.8%）＞尿素（0.5%）。因此，选择牛肉膏+酵母粉作为发酵LS3最佳氮源。

2.4 LS3 菌株最佳发酵温度筛选

图4 为LS3 菌株在不同生长温度下第24、48、72 小时的细菌数量以及在第72 小时下LS3 代谢产物对A.caulina的抑菌率，LS3 在不同发酵温度下生长量表现出差异，同时间相比较，在28 ℃下进行发酵时，菌体数量最多；不同温度下培养LS3 72 h后培养基中菌体数量大小依次为28 ℃＞30 ℃＞26 ℃＞35 ℃。

图4 不同发酵温度对菌株LS3 菌体生长量及代谢物抑菌活性的影响Fig.4 Effects of different fermentation temperature on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

在不同温度下LS3 发酵72 h 后代谢产物对A.caulina的抑制率也表现出差异，28 ℃下发酵代谢产物抑菌率最大，35 ℃下发酵代谢产物抑菌率最小；不同温度下LS3 培养72 h 以后培养基中代谢产物对A.caulina的抑制率大小依次为28 ℃（74.0%）＞30 ℃（71.5%）＞26 ℃（70.8%）＞35 ℃（68.8%）。因此，LS3 最佳发酵温度选择28 ℃。

2.5 LS3 菌株发酵条件优化

以转速、装液量、接种量、pH、发酵时间等5 个因素对发酵条件进行优化，分别测定LS3 菌株在各个不同因素下生长72 h 后的细菌数量，结果如表2所示，第7 组水平组合为A2B3C1D3E4，LS3 发酵终止后菌体数量最多，OD600为2.281。通过分析极差可知，5 个试验因素对LS3 发酵菌体数量影响大小分别为pH（1.873）＞接种量（1.400）＞装液量（0.566）＞发酵时间（0.472）＞转速（0.409），优化水平组合为A2B3C1D3E4，即转速130 r/min，装液量150 mL/300 mL，接种量1%，pH 值7.0，发酵时间96 h。

表2 LS3 菌株发酵条件优化正交试验对菌体数量的分析Tab.2 Analysis of bacterial quantity by orthogonal test of optimization of fermentation conditions of LS3 strain

以转速、装液量、接种量、pH、发酵时间等5 个因素对发酵条件进行优化，分别测定LS3 菌株在各个不同因素下生长72 h后细菌代谢产物对A.caulina的抑制率（表3）。从表3 可以看出，第7 组水平组合A2B3C1D3E4 在LS3 发酵终止以后代谢产物对A.caulina的抑制率最大，为73.55%。通过分析方差可知，5 个试验因素对LS3 发酵代谢产物影响大小分别为pH（50.73）＞接种量（16.71）＞转速（12.67）＞装液量（8.08）＞发酵时间（3.91），优化水平组合为A2B3C1D3E4，即转速130 r/min，装液量150 mL/300 mL，接种量1%，pH 值7.0，发酵时间96 h。

表3 LS3 菌株发酵条件优化正交试验对抑菌率的分析Tab.3 Analysis of inhibition rate by orthogonal test of optimization of fermentation conditions of LS3 strain

结合分析不同水平条件发酵LS3 对菌体数量和抑菌率的影响，可知pH 对发酵过程影响最大。发酵最佳转速130 r/min，最佳装液量150 mL/300 mL，最佳接种量1%，最佳pH 值7.0，最佳发酵时间为96 h。

2.6 LS3 菌株抑菌相关酶活性测定

LS3 酶活性测定结果如图5 所示。

图5 LS3 酶活性测定Fig.5 Detection of LS3 enzyme activity

从图5-A 可以看出，LS3 于酪蛋白培养基培养48 h，在该培养基表面出现明显的透明圈，说明LS3可以分泌胞外蛋白酶。如图5-B 所示，LS3 于几丁质培养基生长48 h，在该培养基表面没有产生较明显的透明圈，说明LS3 无法分泌几丁质酶。如图5-C 所示，LS3 于茯苓粉培养基生长48 h，在该培养基表面没有出现较明显的透明圈，说明LS3 无法分泌β-l，3-葡聚糖酶。如图5-D 所示，LS3 于羧甲基纤维素培养基生长48 h，使用刚果红染色结束，洗去培养基表面的刚果红后出现明显的透明圈，说明LS3 可以分泌β-1，4-葡聚糖酶。

3 结论与讨论

本研究结果表明，LS3 发酵所需最佳培养基为YSP 培养基，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为牛肉膏+酵母粉，发酵最佳温度为28 ℃。正交优化后，LS3 最佳发酵最佳条件为：转速130 r/min、装液量150 mL/300 mL、接种量1%、pH 值7.0、发酵时间96 h。

当前在室内条件下培养芽孢杆菌主要使用LB培养基[13]，但LB 培养基中生长的细菌种类相对单一。黎燕珊等[11]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌HC-8的最佳发酵培养基为YSP；吴至美等[7]研究发现，成团泛菌ZLSY20 菌株的最佳培养基为YSP，与本研究结果相似。

在细菌发酵的过程中，碳源、氮源、温度、发酵时间、pH 等都是比较重要的条件，不同的细菌对以上不同的因子会出现不同的选择差异性[15-17]。本研究发现，LS3 菌株最佳碳源为蔗糖，但其对麦芽糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇等利用效果良好，说明LS3菌株对于碳源的选择范围较广。在氮源筛选方面，LS3 菌株的最佳氮源为牛肉膏+酵母粉，对于蛋白胨、胰蛋白胨等其他氮源也可以利用，但是其在发酵过程中几乎无法利用尿素。魏欣莹等[18]研究发现，芽孢杆菌ZKY01 在生长过程中利用尿素呈阳性；石玉星[19]研究发现，甲基营养型芽胞杆菌MY1在发酵过程中，几乎无法利用尿素，与本试验研究结果相似，因此，利用LS3 菌株在田间防治藜麦黑茎病时，应当控制或减少尿素的施用量。LS3 菌株在25～35 ℃范围内均能生长，表明该菌株对温度的适应性较强。

本研究结果发现，通过正交试验对5 个因素进行正交发酵优化，发现LS3 菌株发酵过程中最适pH 值为7.0。刘冰等[20]研究发现，内生细菌GN232在pH 值为7.0 时获得的发酵液对挤橙溃疡病菌的抑制效果最强，与本研究结果相似。

对LS3 菌株的抑菌活性物质进行测定发现，LS3 菌株可分泌β-1，4-葡聚糖酶及胞外蛋白酶，但不可以分泌几丁质酶和β-l，3-葡聚糖酶。蛋白酶、几丁质酶和β-1，4-葡聚糖酶等胞外酶可抑制病原菌的生长，是内生细菌发挥拮抗作用的重要保障，LS3 菌株可通过胞外蛋白酶及β-1，4-葡聚糖酶分解真菌菌丝结构，进而抑制菌丝生长。今后还可对LS3 菌株抑菌机制进行深入研究，进一步探索其抗菌物质成分。

近年来，芽孢杆菌作为安全、高效的生防菌株倍受人们关注，许多芽孢杆菌具有较广谱的抑菌活性。陈照等[21]从槟榔树根际土壤分离得到1 株贝莱斯芽胞杆菌HAB-9，研究发现，其对17 种常见的病原真菌有较强的抑制作用。高小宁等[22]研究发现，内生枯草芽孢杆菌Em7 具有广谱的抑菌活性，可以抑制10 多种常见的病原真菌，今后可以继续挖掘LS3 菌株对其他病原菌的抑菌活性。