谷子WAK 基因家族全基因组鉴定及表达分析

王 雪，孙玉荣，张 诺，李忠祥，任志贤，张宝俊

（山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801）

植物在自然界与各类病原生物长期的攻防和博弈的过程中[1]，形成了一套高效复杂防御系统以抵御多类病原菌的侵染与为害。由病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）触发的免疫反应（Pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity，PTI）和效应子触发的免疫反应（Effector-Triggered Immunity，ETI）在寄主植物发挥抗病性、阻碍病菌侵染方面起着重要的作用[2]。其中，PTI途径由许多类受体激酶（Receptorlike kinases，RLKs）和类受体蛋白调节作为诱导第一层防御反应的模式识别受体检测PAMP，对非适生性病原菌具有广谱抗性[3]。细胞壁相关激酶（Wall-associated kinases，WAKs）基因家族是一类独特的RLKs 基因，在植物防御病原菌中发挥着重要作用[4]，它们编码的跨膜蛋白具有胞内丝氨酸/苏氨酸激酶（Ser/Thr kinase，STK）结构域和胞外类表皮生长因子（Epidermal growth factor-like，EGFlike）结构域[5]。伴随着WAK 基因家族的鉴定及功能验证研究的深入，其在植物抗病方面的重要作用陆续被证明。研究发现，ZmWAK-RLK1（Htn1）通过减少玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）渗透到宿主组织中而导致感染过程的改变，赋予玉米数量抗性[6]；番茄细胞壁相关激酶SlWAK1 依赖于Fls2/Fls3 促进对假单胞菌（Pseudomonas syringae）的质外体免疫反应[7]；棉花中，GhWAK7A通过调节几丁质信号传导防御棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）[8]；在水稻中，OsWAK91是参与防御水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的候选基因[9]。OsWAK1在水稻中的过表达增强了对稻瘟病菌的抗性[10]；TaWAK7D通过调控小麦多个病程相关基因的表达，正向参与小麦对纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的防御反应[11]；ZmWAK在抗性玉米品种的中胚轴中高度表达[12]。这些发现表明，WAK 基因家族对于植物防御病原菌是必不可少的。

谷子一直被作为主要的杂粮作物在我国栽培[13]，具有悠久的种植历史，在中华文明的形成过程中发挥了重要作用，其营养均衡且对糖尿病、肠胃病、心脑血管疾病等多种疾病有食疗作用[14]。谷子是一种生长能力强、CO2利用率高、需水量少的C4 光合途径作物[15]，在保障全球粮食安全中具有潜在作用。由禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）引起的谷子白发病是一种严重威胁谷子安全生产的主要病害，常年的发病率为20%～30%，一些优良易感品种的发病率甚至达70%以上[16]。随着我国杂粮特色产业的发展，该病害发生面积及发病程度有逐渐增长的趋势，严重威胁着谷子产量和品质的提高，因此，挖掘谷子抗白发病基因及关键调控因子，加速抗白发病品种的选育，对于有效防控谷子白发病的发生发展具有十分重要的意义。WAK基因家族在拟南芥[17]、水稻[18]、棉花[19]、大麻[20]、马铃薯[21]、小麦[22]等植物中已被鉴定，但有关谷子WAK基因家族的研究还未见报道。

为挖掘谷子中WAK 基因的相关功能，本研究利用生物信息学方法对谷子的WAK 基因进行筛选及进一步鉴定，对确定下的谷子WAK 基因家族进行基因定位、蛋白质理化性质分析、进化分析、保守基序分析、顺式作用元件分析，同时对谷子WAK基因家族响应禾生指梗霉早期侵染的表达模式进行分析，旨在为探究WAK 基因家族在谷子生长发育和抗白发病代谢途径中的功能提供理论依据，并为抗白发病分子育种提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 谷子WAK 基因家族成员鉴定

谷子基因组序列从Multi-omics Database forSetaria italica数据库（http://foxtail-millet.biocloud.net/home）中获取。利用TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/）下载14 条拟南芥WAK 蛋白序列，并通过国家水稻数据库中心（http://www.ricedata.cn/index.htm）获取9 条水稻WAK 蛋白序列，利用TBtools 中的BLAST GUI Wrapper 程序、以水稻与拟南芥的WAK 蛋白序列作为探针序列对谷子的全基因蛋白序列进行搜索比对，比对标准为Evalue＜0.01，根据NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Batch-CD-Search 功能进行结构域确定。

1.2 谷子WAK 基因家族蛋白理化性质分析、亚细胞预测及定位

利用在线工具ExPASY-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析谷子WAK 基因家族蛋白的理化性质，主要有氨基酸数量、分子质量和等电点等。利用在线网站（https://wolfpsort.hgc.jp/）对谷子WAK 基因家族的亚细胞定位进行预测。基因定位根据谷子的基因组注释gff3 文件，利用TBtools 对定位结果进行可视化。

1.3 谷子WAK 基因家族进化分析

使用MEGA 7.0 软件对水稻、拟南芥、谷子WAK 基因家族的蛋白序列进行多序列比对，采用Neighbor joining 法（bootstrap 值设定为1 000）构建系统进化树。

1.4 谷子WAK 基因家族保守结构域分析

谷子WAK 基因家族的保守基序借助MEME在线工具（http://meme-suite.org/tools/meme）进行分析，后通过TBtools 对谷子WAK 基因家族的保守基序进行可视化做图。

1.5 谷子WAK 基因家族顺式作用元件鉴定

利用TBtools 软件的Gtf/Gff3 Sequences Extract 程序提取WAK 基因上游2 000 bp 的起始密码子，使用Plantcare 数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）将WAK 基因家族的启动子序列提交至此数据库中，分析谷子WAK 基因家族的顺式作用元件。

1.6 WAK 基因家族响应禾生指梗霉侵染的转录表达分析

试验材料为晋谷21 号（JG21）及晋谷20 号（JG20），由杂粮种质创新与分子育种山西省重点实验室提供。晋谷21 号对谷子白发病具有高感性，晋谷20 号对谷子白发病具有高抗性。

以JG21 和JG20 的2 日龄胚芽鞘为材料，用4×105个/mL 的禾生指梗霉病菌游动孢子悬浮液接种2日龄胚芽鞘。分别于接菌前0 h，接菌后12、24、48、96 h 不同时间段取受侵染的胚芽鞘，放于液氮速冻，-80 ℃保存备用。3 次重复，共计30 份样品，后委托百迈克生物科技有限公司进行RNA 测序。

运用RStudio 在线工具，对谷子WAK 基因响应禾生指梗霉侵染的转录组数据绘制热图并进行分析。

2 结果与分析

2.1 谷子WAK 基因家族筛选、理化性质和基因定位分析

谷子WAK 基因结构域如图1 所示。

利用BLASTP 在xiaomi基因组中共鉴定得到41 个WAK 候选基因，再通过NCBI 数据库中的Batch-CD-Search功能进行结构域确定。其中，41个WAK 候选基因都具有GUB_WAK_bind 结构域（图1），最终筛选得到谷子WAK 基因共41 个。谷子WAK 基因家族编码590～1 131 个氨基酸，平均为800个；其蛋白分子质量为65.62～123.36 ku，等电点为5.18～8.49；Si3g36660、Si7g23280、Si8g19780蛋白亲水性均值均为正值，表现为疏水性；除此之外，其他基因的蛋白亲水性均值均为负值，则其蛋白表现为亲水性。41 个基因中，28 个基因定位于质膜，6 个基因定位于叶绿体，其他基因定位于高尔基体、液泡、内质网、细胞外基质（表1）。在基因定位中，谷子WAK 基因在9 个染色体上均有分布。其中，Chr3 上所包含基因最多，为7 个；Chr2 上的WAK 基因最少，仅有1 个（图2）。

图2 谷子WAK 基因定位Fig.2 WAK gene location in foxtail millet

2.2 谷子WAK 家族成员系统进化分析

系统发育分析表明，谷子、拟南芥和水稻的WAK 基因家族可分为五大类（图3）。其中，I、IV、V 类中仅含有水稻与谷子这2 个物种的WAK 同源基因，I、IV、V 类分别包括6 个谷子WAK 基因及2 个水稻WAK 基因、9 个谷子WAK 基因及3 个水稻WAK 基因、10 个谷子WAK 基因及2 个水稻WAK基因；在II 类中仅包含拟南芥的WAK 同源基因；第III 类中同时包含谷子、拟南芥、水稻的WAK 同源基因，其中，Si1g24650与Os01g26174、Si1g12300与Os02g02120的同源关系最近。

图3 谷子WAK 基因家族系统进化分析Fig.3 Phylogenetic evolution analysis of WAK gene family in foxtail millet

2.3 谷子WAK 基因家族保守结构域分析

对41 个谷子的WAK 基因进行保守基序分析，经分析鉴定其具有8 个基序，命名为Motif 1～Motif 8。其中，Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 在41 个谷子的WAK 蛋白序列中均存在，因此，这5 个基序均较为保守，且这5 个基序都以Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 的先后位置排布（图4-A）。保守基序的序列分析表明，Motif1中的保守序列为ZIDZFINEVAILSQINHRNVVKL LGCCLETEVPLLVYEFISNGTLYELLH，Motif3中的保守序列为KTKIFSLEELEKATNNFDKTR VLGRGGHGTVYKGIL（图4-B）。

图4 谷子WAK 基因家族保守基序分析Fig.4 Conservative motif analysis of WAK gene family in foxtail millet

2.4 谷子WAK 基因家族顺式作用元件分析

谷子WAK 基因家族顺式作用元件分析结果如图5 所示。

图5 谷子WAK 基因家族顺式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements of WAK gene family in foxtail millet

顺式作用元件预测表明（图5），WAK 基因家族顺式作用元件中，与光响应有关的元件较多，说明WAK 基因家族可能参与光合作用并发挥重要作用；同时，赤霉素、茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸的响应元件也分布较多，表明WAK 基因家族在谷子中可能与激素信号紧密相关；在多个谷子WAK 基因家族中都有防御和胁迫响应元件的分布，这说明谷子WAK 基因家族在发挥寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有重要作用。

2.5 WAK 基因家族响应禾生指梗霉侵染的转录表达分析

谷子WAK 基因家族响应禾生指梗霉侵染的转录表达分析显示（图6），共有2 类表达模式，在class Ⅰ中基因Si4g02780、Si7g23280、Si8g19220在JG21 中受到禾生指梗霉侵染48、96 h 表达量显著高于JG20 中的表达量，并在96 h 差异表达最显著，差异倍率分别为4.36、5.64、3.42（图7）。

图7 基因表达量分析Fig.7 Gene expression analysis

class Ⅱ在感病品种JG21 中的表达量整体低于在抗病品种JG20 中的表达量，Si6g20040在JG20中受到禾生指梗霉侵染48、96 h 表达量高，分别为10.39、10.73；Si7g08090和Si8g19780在JG21 和JG20 的表达量均随侵染时间的增加而增加，且在JG20 的各个时间点的表达量均高于JG21 中的表达量，并在48 h 差异表达最显著，差异倍率分别为10.46、2.04（图7）。

3 结论与讨论

细胞壁关联蛋白激酶（Wall-associated kinases，WAKs）是一类特殊的类受体蛋白激酶，在调节细胞生长和防御胁迫反应等方面发挥着重要作用。WAKs/WAKL 在植物对真菌病害的防御反应中起着至关重要的作用[23]。低聚半乳糖苷（OGs）作为胞壁多糖的降解产物，被AtWAK1 所识别[24]。在拟南芥中过表达AtWAK1可以增强对灰霉病的抗性[25]。位于黑穗病数量抗性基因（qHSP1）上的ZmWAK基因的高表达有效地抑制了丝黑穗病菌在中胚轴中的生长[12]。水稻OsWAK14、OsWAK91和OsWAK92正向调控稻瘟病菌的防御反应，而OsWAK112d则负调控防御反应[26]。本研究共鉴定到41 个谷子WAK 基因家族成员，与其他植物中WAK/WAKL 基因启动子顺式作用元件分析结果相类似[27]，本研究谷子WAK 基因启动子区域检测到大量与光响应、植物激素和应激反应相关的基序。Si1g25040、Si3g10590、Si3g32650、Si4g01670、Si4g02770、Si4g02780、Si5g09950、Si7g06570、Si7g08090都含有防御和胁迫响应元件，表明这9 个谷子WAK 基因在发挥寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有调控作用。与未侵染0 h相比，Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在抗病品种晋谷20 号的4 个不同侵染时间中基因上调表达；同时，3 个基因在晋谷21 号不同时间点的表达量均低于晋谷20 号中的表达量，且在48 h 时表达量差异均最显著，推测Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780在阻碍禾生指梗霉侵染方面发挥作用。由于Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在晋谷21 号与晋谷20 号中表达量差异均在48 h 最显著，因此，推测48 h的侵染时间点可能是一个关键侵染时间点。在接下来的研究中，需要进一步研究和挖掘Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在谷子抗感品种的差异表达的原因。本研究结果可为进一步研究谷子的抗病机制及生长发育等提供一定的参考依据。