红芸豆miR395 家族成员的鉴定及其与结瘤相关的表达分析

王东梅，孙丽丽，郑江涛，王利祥，郭数进

（山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801）

芸豆（Phaseolus vulgaris.L）是世界上最重要的经济豆类作物之一，是豆科植物菜豆属籽食性作物的总称。芸豆富含多酚化合物，多酚是具有有效抗氧化特性的次生代谢物，有助于减少氧化应激引起的疾病[1]。红芸豆富含维生素C，钙和铁含量高，蛋白质含量和B 族维生素含量高于鸡肉；红芸豆富含花色苷和皂苷，有降低关节局部炎性组织和缓解疼痛的功效，因此，红芸豆是人们的理想食材，也是山西粮食出口的特色产品[2-4]。红芸豆结瘤固氮，是倒茬养地的重要作物，必将在种植业结构调整、居民膳食结构改善及区域粮食基本自给中发挥重要的作用；固氮不仅是保障红芸豆高产的关键，也是防止氮肥过度施用减轻环境问题的关键作物[5-7]。

近些年，许多研究报道了microRNA 调节豆科植物的结瘤固氮过程，比如在蒺藜苜蓿中，mtrmiR156通过影响苜蓿的固氮效率和苜蓿根系的再生能力调节固氮[8]；在大豆中，gma-miR172c通过靶向下游的NNC1来调节大豆结瘤起始[9]；在花生中，ahy-miR399、ahy-miR159和ahy-miR3508等microRNA 都参与调控花生结瘤[10]。MicroRNA（miRNA）是一类常见于真核生物中的内源性非编码RNA，一般由20～22 个核苷酸组成[11]。在植物中，miRNA 通常与靶基因内的互补位点结合，实现在转录后水平抑制靶基因的表达，从而调节植物生长、发育和对逆境的响应。研究发现，拟南芥miR395通过靶向调控ATP 磺酰化酶（APS）编码基因表达而影响其硫酸盐的积累和分配[12]；水稻miR395靶向抑制硫酸盐转运蛋白基因（AST）的表达，促进硫酸盐积累，miR395过表达的株系中表现出对细菌病原体的广谱抗性[13]。值得注意的是，miR395是调节硫吸收和转运的关键调节因子，而硫元素作为植物的必需营养素，是一些氨基酸、金属辅因子、辅酶和次生代谢产物的关键组成元素[14]。硫饥饿会影响植物的生长、光合作用和产量。在豆科植物中，硫吸收正向调控结瘤固氮（SNF），硫饥饿会导致结瘤减少、抑制固氮效率和降低根瘤代谢等现象[15]，因此，推测其可能参与调节豆科植物的共生结瘤过程。

为探明miR395家族成员是否响应根瘤菌的侵染调控共生结瘤，本研究利用生物信息学对芸豆的miR395家族成员（pvu-miR395）进行全基因组鉴定，并对其染色体分布、碱基保守性、二级结构进行系统分析，预测pvu-miR395家族成员的启动子顺式作用元件和靶基因，并利用实时荧光定量PCR检测pvu-miR395家族成员在红芸豆根瘤的表达和对根瘤菌侵染的响应情况，旨在为进一步深入研究pvu-miR395家族在芸豆生长发育和结瘤固氮中的生物学功能提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试红芸豆品种是品金芸4 号，由山西农业大学农业基因资源研究中心畅建武研究员和郝晓鹏博士提供。

1.2 方法

1.2.1 芸豆miR395的全基因组鉴定 从PmiREN[16]数据库（https://www.pmiren.com/）获取pvu-miR395家族成员的前体序列、成熟序列以及在染色体上的位置信息。

1.2.2 芸豆miR395的序列及结构分析 根据在PmiREN 数据库下载的pvu-miR395家族成员成熟序列和星标序列，利用MEGA-X 软件对其进行序列比对，然后通过WebLogo（https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析pvu-miR395家族成员成熟序列和星标序列的碱基保守性。使用RNAfold（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）预测pvu-miR395前体的二级茎环结构，采用折叠算法选择最小自由能和分配函数。

1.2.3 构建pvu-miR395家族的进化树 从Pmi-REN 数据库中下载大豆（Glycine max）、苜蓿（Medicago truncatula）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的miR395家族成员的前体序列，利用MEGA-X 软件构建pvu-miR395家族成员前体序列和以上4 个物种的miR395前体序列的进化树，采用最大似然法计算，系统参数设置为默认值。

1.2.4pvu-miR395家族成员的启动子顺式作用元件分析 在PmiREN数据库下载pvu-miR395家族成员的上游2 000 bp作为其启动子序列，输入PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线数据网站，对其顺式作用元件进行预测分析。利用TBtools 软件对pvu-miR395基因家族顺式作用元件进行分析并绘制热图。

1.2.5pvu-miR395靶基因预测 使用psRNATarget（https://www.zhaolab.org/psRNATarget/）预测pvu-miR395的靶基因，系统参数设置为默认值。选取最大期望值≤2 的基因作为靶基因，分析pvumiR395与候选靶基因的相互作用位点。此外，使用Phytozome 数据库（https://phytozome-next.jgi.doe.gov）对所预测的靶基因进行功能注释。

1.2.6 RNA 提取和qRT-PCR 分析 红芸豆培养至长出三出复叶，用OD600=0.08 的芸豆根瘤菌R.etliCFN42（Bradyrhizobium etli）[17]处理红芸豆幼苗，采集接菌28 d 后的根、叶和根瘤组织，检测pvumiR395基因家族成员在这3 个组织中的相对表达水平。同时，采集接菌后0、1、3、6、12、24 h 的根组织，检测pvu-miR395基因家族在这6 个时间点的相对表达水平。

用Trizol 法提取芸豆的RNA[18]，通过1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测RNA 纯度和含量。使用反转录试剂盒TransScript®miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 将其反转录为cDNA。以cDNA 为模板进行qPCR 检测，上游的特异引物根据所检测的miR395成熟序列进行设计（表1），下游的引物均为反转录试剂盒自带引物Universal miRNA qPCR Primer，用U6作为内参基因[19]。实时荧光定量PCR 采用试剂盒PerfectStart®Green qPCR SuperMix，根据说明书对样品进行qRT-PCR 操作。

表1 研究所用的引物序列Tab.1 Primer sequence in this study

1.3 数据分析

按照公式（2－ΔΔCt，ΔCt＝Ct 目标基因-Ct 内参基因）进行数据分析，为了保证试验的准确性，每个样品3 个技术重复。设定处理前（0 h）的材料数据为对照进行相对表达量分析。

2 结果与分析

2.1 pvu-miR395 家族成员的鉴定及染色体定位分析

为系统鉴定pvu-miR395家族成员，本研究从PmiREN 数据库搜索共获得位于芸豆基因组的8 个miR395家族成员，分别命名为pvu-miR395a～pvu-miR395h（表2）。其中，pvu-miR395家族成员的成熟序列和星标序列均含有21 个碱基，成熟序列比对结果显示，pvu-miR395a、pvu-miR395b和pvu-miR395c高度保守，pvu-miR395e、pvu-miR395f和pvu-miR395g高度保守（图1-A）。星标序列比对结果同样显示其碱基高度保守（图1-B）。pvumiR395家族分布在第2 号和第3 号染色体上，其中，第2 号染色体上包含pvu-miR395395a、pvumiR395b、pvu-miR395c和pvu-miR395d等4 个成员，其余的pvu-miR395e、pvu-miR395f、pvumiR395g和pvu-miR395h位于第3 号染色体上。

图1 pvu-miR395 家族成员成熟序列（A）和星标序列（B）碱基保守性分析结果Fig.1 Conservative analysis of mature sequence（A） and star sequence（B） of pvu-miR395 family members

表2 pvu-miR395 家族成员的基本信息Tab.2 Basic information of pvu-miR395 family members

2.2 pvu-miR395 家族成员前体序列的二级结构分析

microRNA 的前体序列决定成熟microRNA 的表达和序列。为了进一步了解pvu-miR395家族成员的作用模式，从PmiREN数据库获取8个pvu-miR395家族成员的前体序列，最长的pre-pvu-miR395f为104 bp，最短的pre-pvu-miR395e为68 bp。二级结构预测结果表明，所有pre-pvu-miR395均能形成稳定的二级茎环结构，并且所有pvu-miR395家族成员的成熟microRNA 均位于前体序列的5′臂上（图2）。

图2 pvu-miR395 家族成员前体序列的二级结构预测Fig.2 Secondary structure prediction for precursor of pvu-miR395 gene family members

2.3 pvu-miR395 家族成员的系统进化树分析

芸豆与其他植物miR395家族成员系统进化树如图3 所示。

图3 芸豆与其他植物miR395 家族成员系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of miR395 family members of Phaseolus vulgaris and other plants

为了解pvu-miR395家族成员的功能特征和进化关系，将芸豆的8 个miR395家族成员的前体序列与大豆、苜蓿、拟南芥和水稻中的miR395家族成员的前体序列构建系统进化树，经鉴定发现，在拟南芥、苜蓿、水稻、大豆中分别存在6、12、20、23 个miR395家族成员，进化树结果显示（图3），miR395家族成员共分为四大组，其中，第Ⅰ组和第Ⅳ组成员较多（23～27 个），第Ⅱ、Ⅲ组成员较少（7～12 个）。在同一亚家族内，种内的miR395序列比种间更容易聚类在一起。其中pvu-miR395家族成员分布于4 个组中，每个组中均包含2 个pvu-miR395家族成员。

总的来说，大豆、苜蓿和芸豆的miR395前体序列比拟南芥、水稻更容易聚类在一起，表明芸豆miR395家族成员与豆科类作物大豆和苜蓿的亲缘关系较近，其次与双子叶植物拟南芥较近，而与单子叶植物水稻的亲缘关系较远。有意思的是，Group Ⅰ的23 个家族成员96%来源于蒺藜苜蓿、大豆和芸豆，Group Ⅲ的7 个家族成员全部来自于这3 个物种，Group Ⅰ和Group Ⅲ中包含3 个由大豆和芸豆序列聚类而成的亚亚支，1 个由蒺藜苜蓿和芸豆序列聚类而成的亚亚支，推测这可能是豆科植物进化出了特异的分支，参与调控豆科植物结瘤固氮的调控。

2.4 pvu-miR395 家族成员启动子分析

位于启动子上的顺式作用元件是决定基因表达的关键，为分析pvu-miR395的表达模式，首先对pvu-miR395启动子区域的顺式作用元件进行分析，结果如图4 所示，8 个pvu-miR395均含有丰富的顺式作用元件，大多数pvu-miR395启动子包含与植物激素、胁迫、生长和发育有关的顺式作用元件。生长发育元件主要包括光响应顺式作用元件G-box、Box4 和分生组织表达相关的顺式作用元件CATbox；与植物激素相关的响应元件主要包括参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE、乙烯响应元件ERE、水杨酸响应元件TCA 和赤霉素响应元件Pbox；与胁迫相关的响应元件主要包括与厌氧相关的响应元件ARE、与干旱相关的响应元件MYB 和MYC、应激响应相关的顺式元件W-box 和as-1。顺式作用元件在不同pvu-miR395启动子中不均匀分布，而在pvu-miR395家族成员的启动子区域包含较多的MYB、MYC 元件，说明pvu-miR395可能与芸豆耐逆相关。除此之外，pvu-miR395家族成员的启动子区域还包含较多的与厌氧相关的响应元件ARE 和激素响应元件，植物激素和厌氧环境对豆科植物的结瘤和固氮非常重要，暗示了pvumiR395在芸豆结瘤固氮中的关键作用。

图4 pvu-miR395 家族成员顺式作用元件分析Fig.4 cis-acting elements analysis of pvu-miR395 family members

2.5 pvu-miR395 家族成员的表达模式分析

为进一步验证pvu-miR395是否参与芸豆结瘤调控，采用qRT-PCR 分析pvu-miR395家族成员在红芸豆的根、叶及根瘤中的表达模式，结果如图5所示，所有pvu-miR395家族成员在红芸豆根瘤中的表达极显著高于根和叶中的表达量（P＜0.001，图5-A、B、C、D）。进一步验证红芸豆pvu-miR395家族成员是否响应根瘤菌处理，对根瘤菌处理0、1、3、6、12、24 h 的红芸豆的根进行qRT-PCR，结果表明，红芸豆根中pvu-miR395的表达量随根瘤菌处理时间呈现先升高后降低的趋势，且在处理6 h 时的表达量最高。但值得注意的是，在根瘤菌处理6 h时，pvu-miR395a/b/c的表达仍显著低于对照（根瘤菌未浸染）的表达量（P＜0.05，图5-E），而其余5 个pvu-miR395成员均极显著高于对照（P＜0.01或P＜0.001，图5-F、G、H），说明pvu-miR395在6 h时被根瘤菌强烈诱导，推测该miRNA 在此时发挥着重要作用。这些结果表明，所有pvu-miR395的家族成员都在结瘤早期响应根瘤菌的侵染，参与调控芸豆结瘤。

图5 pvu-miR395 家族基因在不同组织和响应根瘤菌侵染的相对表达量Fig.5 Relative expression of pvu-miR395 family members in different tissues and in response to rhizobia infection

2.6 pvu-miR395 家族成员的靶基因预测及功能注释

MicroRNA 通常通过调控下游靶基因的表达发挥作用，为了进一步验证pvu-miR395家族在结瘤固氮中的功能，通过psRNATarget 在线预测结果，共获得3 个pvu-miR395可能的靶基因（表3），2 个硫酸盐转运蛋白和1 个硫酸腺苷酰基转移酶。

表3 pvu-miR395 家族成员的靶基因预测及功能注释Tab.3 Target gene prediction and functional annotion of pvu-miR395 family members

3 结论与讨论

红芸豆是山西的特产，其具有丰富的营养价值和较高的药用价值。作为一种豆科植物，其生长发育离不开共生结瘤与固氮，当豆科植物被根瘤菌侵染时，植物会产生类黄酮类物质，诱导根瘤菌形成结瘤因子，进而促使根毛弯曲和侵染线形成，以此诱导根瘤发育和共生固氮[20]。近年研究表明，除了大量的功能基因参与调控豆科植物的结瘤固氮，一系列的非编码基因比如microRNA 也参与调控豆科植物的结瘤固氮过程[21-26]，本研究首次系统鉴定了pvu-miR395家族成员，并初步探究了pvu-miR395在红芸豆结瘤固氮中的作用，发现pvu-miR395家族成员在红芸豆根瘤中高表达，并受根瘤菌侵染的诱导，同时也预测到其有3 个罚分为2 以下的靶基因，分别是硫酸盐转运蛋白和硫酸腺苷酰基转移酶，pvu-miR395家族成员可能通过调节这些靶基因表达水平来影响芸豆的生长发育，这与已报道的拟南芥和水稻中miR395的靶基因预测结果一致[12-13]。前人研究发现，硫与碳一样对共生固氮的调节和功能至关重要，固氮酶的生物合成依赖于高浓度硫酸盐吸收。硫是植物中必需的营养元素，可以提高作物产量、改善作物品质。在豆科植物中，硫供应可以增强豆科植物的固氮能力，与共生固氮呈正相关[15,27]。进一步佐证pvu-miR395通过靶向硫酸盐转运蛋白和硫酸腺苷酰基转移酶在结瘤固氮过程中起到关键作用。

本研究通过生物信息学从芸豆基因组中鉴定出8 个miR395的家族成员，这些miR395分布在第2、3 号染色体上，依次命名为pvu-miR395a～pvumiR395h。pvu-miR395成熟序列和星标序列碱基高度保守，8 个miR395成员均可形成较稳定的二级茎环结构。顺式作用元件分析发现，该家族成员可能参与植物激素、胁迫、生长和发育等过程。系统进化树分析发现，pvu-miR395的家族成员与大豆和苜蓿的亲缘关系更近。qRT-PCR 分析发现，pvu-miR395家族成员在芸豆的根瘤中高表达，且pvu-miR395家族成员的表达显著抑制根瘤菌的侵染。靶基因预测表明，pvu-miR395家族成员可能靶向硫酸盐转运蛋白（Phvul.001G250700.1、Phvul.008G170700.1）和硫酸腺苷酰基转移酶（Phvul.007G062900.1）参与调控芸豆的共生结瘤。通过基因工程手段改造pvu-miR395和靶基因的表达，将有助于提升红芸豆的固氮效率，在提升红芸豆的产量的同时减少氮肥的使用，提高农业的可持续发展。