越橘花青素提取工艺优选及树脂纯化工艺研究

刘 梅，郝长伟

（1.东营市第二人民医院药学部，山东 东营 257335；2.包头东宝生物技术股份有限公司，内蒙古 包头 014030）

花青素（Anthocyanin）又称花色素、花色苷，属于生物类黄酮物质，是一种广泛存在于植物中的天然色素。花青素具有很强的生物活性，可发挥抗氧化、清除自由基、缓解视力疲劳、预防阿尔茨海默病等作用，已成为近年来的研究热点[1-2]。相对于化学制剂，天然成分安全性更高，备受人们青睐。如何简化天然成分提纯工艺、降低成本、提高收率已成为研究者关注的热点问题。基于此，本试验对越橘花青素提取工艺和纯化工艺进行研究，确定最佳工艺参数，为越橘花青素的后续开发利用提供研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

越橘果：经鉴定为杜鹃花科越橘属（Vaccinium Spp）浆果类植物果实，低温贮藏备用。试剂：浓盐酸；甲醇（分析纯），无水乙醇，飞燕草素对照品（纯度≥97%），氢氧化钠（分析纯），盐酸（分析纯），95% 乙醇（分析纯），水（超纯水），大孔树脂（D101，AB-8，DA201-C）。

1.2 仪器和设备

AB204-S 型电子分析天平（德国Sartorius），HH-S8 型数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司），Alpha-1900S 双光束扫描型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司），GT10-1 型高速台式离心机（河北医众医疗器械有限公司），冷冻干燥机（上海继谱电子科技有限公司），SHB-IIIS 型台式循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），N-1300V-WB 旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社），CHA-SA 空气浴振荡器（常州市国旺仪器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料前处理 挑选成熟度均一的越橘果，清洗、沥干表皮水分、打浆，置于冷冻干燥机中预冻4 h，冻干36 h，粉碎，过80 目筛，制成越橘冻干粉，于-10 ℃密封避光保存备用[3]。

1.3.2 供试品溶液制备[3]取越橘冻干粉5 g，精密称定，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入一定体积和确定pH 值的乙醇溶液，置于预先设定好的水浴温度下浸提一段时间。提取结束后，将提取液倒入离心管中，置于冷冻离心机中离心10 min，转速为4000 r/min。取1 mL 上清液置于100 mL 棕色容量瓶中，用2%盐酸-甲醇稀释至适量，置于80 ℃水浴锅中水浴30 min，冷却。加2% 盐酸- 甲醇稀释至刻度线，摇匀，取1 mL置于100 mL 棕色容量瓶中，用2%盐酸-甲醇定容，摇匀、滤过，即为供试品溶液，备用。

1.3.3 吸光度的测定 精密称取飞燕草素对照品5 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入2% 盐酸- 甲醇定容至刻度线，摇匀，精密称取1 mL 置于25 mL 容量瓶中，用2% 盐酸- 甲醇定容稀释，摇匀，即为对照品溶液，备用。精密称取飞燕草素对照品溶液，加2% 盐酸-甲醇制成飞燕草素质量浓度分别为1.10 μg/mL、3.31 μg/mL、5.52 μg/mL、6.62 μg/mL、8.83 μg/mL的对照品溶液。以2% 盐酸- 甲醇溶液为空白，采用紫外可见分光光度法，于540 nm 波长处测定吸光度。以飞燕草素浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.1002x+0.0172，R2=0.9995，线性关系良好。以2% 盐酸- 甲醇作为空白试剂，取供试品溶液适量，于540 nm 波长处测定吸光度，计算样品中飞燕草素质量浓度。花青素的含量以飞燕草素质量分数计，花青素提取率（%）=

1.3.4 单因素实验

1.3.4.1 乙醇浓度 称取越橘冻干粉5 g，置于100 mL容量瓶中，分别加入浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，按1.3.2 项下操作，测定吸光度，确定最佳提取乙醇浓度。

1.3.4.2 料液比 称取越橘冻干粉5 g，置于100 mL 容量瓶中，按料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50分别加入60%的乙醇，按1.3.2 项下操作，测定吸光度，确定最佳料液比。

1.3.4.3 提取温度 称取越橘冻干粉5 g，置于100 mL容量瓶中，加入60% 的乙醇，分别于35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃下浸提，按1.3.2 项下操作，测定吸光度，确定最佳提取温度。

1.3.4.4 提取时间 称取越橘冻干粉5 g，置于100 mL容量瓶中，加入60% 的乙醇，分别浸提30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，按1.3.2 项下操作，测定吸光度，确定最佳提取时间。

1.3.5 正交试验 在单因素实验结果的基础上，设置乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4 个因素，设计L9（34）正交试验，重复3 次，筛选出提取越橘花青素的最佳提取工艺，正交试验因素水平设计表见表1。

表1 越橘花青素提取条件正交试验因素水平设计表

1.3.6 纯化工艺研究

1.3.6.1 大孔树脂预处理 称取一定量的大孔树脂，置于95% 乙醇中浸泡24 h，用蒸馏水冲洗至pH 值为中性。用2 ～3 倍树脂体积的NaOH 溶液（0.1 mol/L）浸泡5 h，用蒸馏水洗至pH 值为中性。用2 倍树脂体积的HCL 溶液（0.1 mol/L）浸泡5 h，用蒸馏水洗至pH 值为中性，备用。

1.3.6.2 花青素提取液的处理 取一定量最佳工艺条件下提取的花青素提取液，减压浓缩，倒入离心管中，置于冷冻离心机中离心10 min，转速为4000 r/min，取上清液，加蒸馏水稀释后备用。

1.3.6.3 树脂型号的选择 备选出三种树脂型号，分别为AB-8、D101、DA201-C。精确称取三种树脂各20.00 g，置于锥形瓶中，各加入50 mL 花青素提取液，密封，放入恒温摇床（温度25 ℃，转速100 r/min）振荡5 h。分别测定3 种型号大孔树脂吸附花青素提取液的吸光值A1，并计算吸附率。精确称取已吸附花青素的三种树脂各20.00 g，分别置于锥形瓶中，用蒸馏水冲洗，各加入80% 乙醇溶液50 mL，密封，置于恒温摇床（温度25 ℃，转速100 r/min）振荡5 h。分别测定解析后液体的吸光度A2，并计算解吸率。

1.3.6.4 花青素提取液pH 值的选择 取适量花青素提取液5 份，加入盐酸，使pH 值分别为1.0、1.5、2.0、

2.5、3.0，分别测定吸光度A0。进行动态吸附试验，上样流速为1.0 mL/min，通过吸光度A 的变化计算出吸附率。

1.3.6.5 吸附时间的选择 精密称取5 g 已预处理的D101 树脂，置于100 mL 锥形瓶中，加入花青素提取液50 mL，封口后置于转速120 r/min 的振荡器中振荡，每隔1 h 测定吸光度A，记录12 h 内花青素吸光度A的变化，计算吸附率。

1.3.6.6 洗脱速率的选择 精密称取5 份预处理好的D101 树脂，每份5 g，湿法装柱，树脂体积大约10 mL，加入花青素提取物（浓度为3.81 mg/mL），控制流速为1 mL/min，上样体积为5 BV，待样液全部通过树脂后，加蒸馏水洗脱至无色，加入80% 乙醇50 mL进行动态洗脱，分别控制洗脱速率为0.5 BV/h、1.0 BV/h、1.5 BV/h、2.0 BV/h、2.5 BV/h，通过吸光度A的变化计算解吸率。

1.3.6.7 乙醇浓度的选择 精密称取5 份已吸附花青素的饱和树脂，各40.00 g，用蒸馏水冲洗，分别加入乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90% 的酸性乙醇溶液洗脱柱子，进行动态解析试验，控制速率为1.0 BV/h，通过吸光度A 的变化计算解吸率。

1.3.6.8 洗脱液pH 值的选择 精密称取5 份已吸附花青素的饱和树脂，各40.00 g，用蒸馏水冲洗，分别加入pH 值为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 的乙醇溶液洗脱柱子，进行动态解析试验，控制洗脱速率为1.0 BV/h，通过吸光度A 的变化计算解吸率。

2 试验结果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对越橘花青素提取率的影响 由图1 可知，随着乙醇浓度的增加，越橘花青素提取率整体呈现先增后降的趋势。当乙醇浓度达到50% 时，越橘花青素提取率达到最高，为55.43%。根据相似相溶原则，50% 乙醇极性与越橘花青素极性相似，越橘花青素提取率最大，随着乙醇浓度的增加，乙醇极性发生变化，越橘花青素含量降低，故确定50% 乙醇为提取越橘花青素的最佳溶剂。

图1 乙醇浓度对越橘花青素提取率的影响

2.1.2 料液比对越橘花青素提取率的影响 如图2 所示，随着料液比的增加，提取溶剂与越橘冻干粉接触面积增大，促进越橘花青素的溶出。当料液比为1:30 时，到达饱和状态，此时越橘花青素提取率为58.11%。继续增加料液比，越橘花青素提取率降低，可能是由于料液比过大导致色素浓度稀释，色素分子间作用力减小，使越橘花青素稳定性降低，从而导致部分花青素分解[4]。此外，持续增加料液比易使杂质产生，并且造成物料浪费，故选择1:30 作为最佳料液比。

图2 料液比对越橘花青素提取率的影响

2.1.3 提取温度对越橘花青素提取率的影响 如图3 所示，当温度为35 ℃～55 ℃时，越橘花青素并不稳定，提取率在55%～57%之间。当温度达到65 ℃时，越橘花青素含量最高，此时提取率为59.63%。研究表明，花青素的稳定性和温度有关，高温不易造成花青素糖苷水解[5]。故选择65 ℃作为最佳提取温度。

图3 提取温度对越橘花青素提取率的影响

2.1.4 提取时间对越橘花青素提取率的影响 如图4 所示，在一定提取时间内，越橘花青素提取率呈现先增后降的趋势。提取时间为60 min 时，越橘花青素提取率高达58.08%。60 min 后，越橘花青素含量逐渐减少，这可能与空气氧化、溶解饱和、产生杂质以及花青素热稳定性有关[3]。故选择60 min 作为最佳提取时间。

图4 提取时间对越橘花青素提取率的影响

2.2 正交试验结果

通过正交试验和方差分析表明，诸因素对试验结果影响的主次顺序为A ＞B ＞D ＞C，即乙醇浓度影响因素最大，其次为料液比，提取温度和时间影响较小，故A2B2C2D2 组合最佳，即乙醇浓度为50%，料液比为1:30，提取温度为65 ℃，提取时间为60 min。试验数据详见表2。

表2 越橘花青素提取正交试验结果

2.3 纯化工艺研究结果

2.3.1 不同树脂型号对越橘花青素吸附率和解吸率的影响 如表3 所示，三个型号（AB-8、D101、DA201-C）树脂对越橘花青素吸附率影响的主次顺序为DA201-C ＞D101 ＞AB-8；三个型号树脂对越橘花青素解吸率影响的主次顺序为D101 ＞AB-8 ＞DA201-C。根据吸附率和解吸率综合考虑，采用D101 型号树脂作为吸附材料。

表3 不同树脂型号越橘对花青素吸附率和解吸率的影响

2.3.2 不同pH 值越橘花青素提取液对D101 树脂吸附的影响 从图5 可知，不同pH 值的越橘花青素提取液对D101 树脂的吸附能力有一定的影响，当上样样品pH 值为1.5 时，此时该树脂吸附越橘花青素的能力最强，吸附率达到65.94%，故将上样样品pH 值定为1.5。

图5 不同pH 值越橘花青素提取液对D101 树脂吸附的影响

2.3.3 不同吸附时间对D101 树脂吸附的影响 从图6可知，D101 大孔树脂对越橘花青素的吸附率随着吸附时间的延长而增大。当吸附时间为3 h 时，该树脂对越橘花青素的吸附率达到92.69%，继续延长吸附时间，D101 树脂对越橘花青素的吸附率上升减慢，到12 h 时 吸 附 率 达 到93.46%。表 明 吸 附3 h 后，D101 树脂已接近饱和状态，故选择3 h 为最佳吸附时间。

图6 不同吸附时间对D101 树脂吸附的影响

2.3.4 不同洗脱速率对D101 树脂解吸率的影响 从图7 可知，当洗脱速率为1 BV/min 时，D101 树脂的解吸率出现峰值，解吸率为92.21%，继续加快洗脱速率，越橘花青素解吸率逐渐降低，故选择1 BV/min 为洗脱速率。

图7 不同洗脱速率对D101 树脂解吸率的影响

2.3.5 不同乙醇浓度对D101 树脂解吸率的影响 从图8 可知，D101 树脂解吸能力随着乙醇浓度的增大而增强，当乙醇浓度为80% 时，D101 树脂对越橘花青素的解吸能力最强，解吸率为88.76%，故选择80% 乙醇作为洗脱剂。

图8 不同乙醇浓度对D101 树脂解吸率的影响

2.3.6 不同pH 值洗脱液对D101 树脂解吸率的影响从图9 可知，D101 树脂解吸能力随着洗脱液pH 值的增加而下降，故选择洗脱液pH 值为1.0。

图9 不同pH 值洗脱液对D101 树脂解吸率的影响

2.3.7 纯化工艺结果考察 根据上述试验结果，确定最佳纯化工艺为：上样液pH 为1.5，吸附时间为3 h，洗脱液为80% 乙醇，洗脱液pH 为1.0，洗脱速率为1 BV/h。

2.3.8 工艺验证试验结果 根据最佳纯化工艺条件，进行3 次验证试验，结果表明该工艺条件稳定可行。试验数据详见表4。

表4 验证试验结果（%）

3 讨论

花青素是一种水溶性黄酮类色素，易溶于水、乙醇、丙酮等溶剂。由于水的极性太大，提取花青素时易产生杂质，同时丙酮毒性过大，且价格较高，故本试验选择安全低毒、价格成本较低的乙醇作为提取溶剂。花青素的稳定性受本身结构和外界环境等因素的影响，尤其对pH 值、温度、光照、金属离子、氧化剂等因素敏感。在提取工艺优化的过程中，乙醇浓度和提取温度对花青素提取率的影响变化明显，尤其是随着乙醇浓度的增加，花青素提取率逐渐出现峰值，继续增加乙醇浓度，花青素提取率则变化不规律。在提取过程中，要依据相似相溶原理，从氧化、溶剂饱和、杂质等多方面考虑，选择最佳的提取工艺参数。

越橘经提取后，提取液中除花青素外，还存在大量淀粉、胶质等物质，对其后续的稳定性有影响，因此，我们进一步对花青素提取液纯化。文献[6]表明，目前花青素分离纯化的方法有：膜分离法、柱层析法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法，其中应用大孔树脂对花青素柱层析是纯化花青素的主要方法。大孔树脂操作简单，可再生重复利用，并且试验成本较低，故本试验以越橘花青素吸附率和解吸率为指标，对大孔树脂型号及具体步骤参数进行优化选择，确定最佳纯化工艺。另外，本试验中未考察柱子的粗细。有研究表明，若柱子过细，洗脱时易出现树脂结块、壁上气泡、流速降低等现象[7]。故在后续试验中可以增加柱子粗细的考察，进一步优化越橘花青素纯化工艺。

综上所述，越橘花青素的最佳提取工艺参数为乙醇浓度50%，料液比1:30，提取温度65 ℃，提取时间60 min ；越橘花青素最佳纯化工艺为以D101 树脂为吸附树脂，最佳吸附条件为：越橘花青素提取液pH 值为1.5、吸附时间为3 h，采用80%乙醇溶液洗脱，洗脱液pH 值为1.0，洗脱速率为1.0 BV/h。