基于空间位移拉曼光谱的皮肤含水量无创检测

袁榕穗，吴植强，聂荣志，钟文婷，张克勤

（1 广西食品药品审评查验中心，南宁 530000）

（2 广西医疗器械检测中心，南宁 530000）

（3 贺州学院 公共基础教学部，贺州 542899）

（4 苏州大学 纺织与服装工程学院，苏州 215021）

0 引言

成年人体重的约60%是水，具体取决于年龄，性别等因素。人体脱水或水合过度会导致严重的健康问题，并可能伴随各种医疗状况。在健康老龄化和医疗保健成本不断增加的时代，脱水导致大量的老年人入院治疗，同时水合过度也与脱水一样频繁发生。此外，在耐力运动中，许多生理参数被监测以优化表现，十分需要直接测量机体含水量。总之，存在许多可能导致过度水合或脱水的医疗状况以及急性事件，及时干预和适当的管理需要可靠的水合状态分析。然而目前还没有快速简单，非侵入性的方法可以可靠地测量和监测某人的水合作用状态［1］。

皮肤是人体主要蓄水池之一，含水量占全身的18%～20%，是理想的机体含水量检测位置。目前皮肤含水量的研究主要以电学法［2-3］和拉曼光谱法［4］为主，其中电学法基于皮肤的电导或电容特性计算含水量，除检测皮肤样品外还可检测人体活体，但使用前需要对皮肤严格的清洁以及等待清洁后恢复正常状态的时间，准确度依赖清洁的效果，实际使用时非常不便利。拉曼光谱法可直接识别水的光谱信号强度，在体外皮肤样本含水量检测中展现了很高的精度，但面对活体检测时有着穿透深度不足、难以聚焦以及依赖中大型光谱仪的缺点，未能应用到人体活体实验中。

空间位移拉曼光谱技术穿透性更强，可很大程度的减少皮肤表面水份、油脂等污染物的干扰，更换被测人时不需要重新校准光路，激发光斑大可避免皮肤刺痛感，但现有的空间位移拉曼光谱装置激发点和收集点之间的空间位移量一般为几个毫米，最常用于穿透药瓶等包装材料，若应用于生物探测时会忽略皮肤厚度，采集到来自皮下的信号，因此更适用于皮下，例如骨信号的检测［5-9］。当应用于皮肤检测时，水信号占比极小，光谱收集效率低，而且受限于机械结构和光学元件尺寸，难以缩小空间位移量。

本研究没有使用传统空间位移拉曼光谱装置的机械偏移或者遮挡实现激发点和收集点的相对位移，而是设置了可微移的光源，利用光源与激发点的共轭关系调节空间位移量，同时引入显微成像光路控制调节，最终实现了小于1 000 μm 的空间位移量的连续可调，应用于皮肤含水量的检测，通过对不同空间位移量下光谱数据的分析，最终在300 μm 的最优条件下实现了皮肤中水信号的检测，并报道了基于拉曼光谱的皮肤含水量无创检测。

1 实验部分

1.1 实验装置

用于对比的检测方法为电学法，使用了Real Bubee 公司的RB-916 型皮肤水份测试仪。使用时将电极按压到待测皮肤上，单次测量时间大约5 秒，仪器根据电导率等信号可直接给出含水量。空间位移拉曼激发和收集装置为实验室搭建，考虑到人体检测需要仪器可移动，以及探头和光谱仪分离［10-11］，光谱仪采用了可便携的光纤光谱仪［12］，型号为Wasatch Photonics 公司的WP785ER 型拉曼光谱仪。

图1 为空间位移拉曼实验装置的示意图，整套装置由采样区（Sampling region）、激发区（Excitation region）、收集区（collecting region）和成像区（Imaging region）组成，其中采样区为激发和收集光路共用，成像区用来确定空间位移量。

图1 空间位移拉曼装置Fig. 1 Device of spatially offset Raman spectroscopy

激发光路：光源采用QPhotonics 公司波长为761 nm 的单模光纤输出激光器（Laser），光谱宽度0.2 nm，功率为100 mW，经过镜头1（Lens1）准直后由窄带通滤光片1（Filter1）去除边频，以45 度角入射到二向色镜1（Dichroscope1）表面，经反射后由镜头2（Lens2）聚焦于样品（Sample）位置，最终可达皮肤的激光功率为80 mW，光斑直径约为15 μm。被测位置放置平面窗口（Platewindow），测量时用手按压，保持不动，测量时间为30 s。除此之外，平面窗口在光路校正时还起到反射信标光斑的作用，激发光路或者收集光路都可向平面窗口发射一束信标光，其中被反射的光的强度足够被成像光路产生清晰的光斑像，用以确定光斑的尺寸和位置。

收集光路：样品受激发后产生的拉曼散射光信号由镜头2（Lens2）收集并准直，输送到二向色镜1（Dichroscope1），二向色镜1（Dichroscope1）允许波长大于激发光的信号通过，但还有约百分之一的激发光残余，为粗滤。粗滤后的光由二向色镜2（Dichroscope2）反射转向滤光片2（Filter2），滤光片2（Filter2）为Semrock 公司OD=7 的长通滤光片，可将残余激发光的强度降为百万分之一，为精滤，精滤后的光由镜头3（Lens3）耦合进光纤光谱仪（Spectrograph），形成拉曼散射光谱。

成像光路：粗滤后残余的激发光穿过二向色镜2（Dichroscope2），由镜头4（Lens4）投射到像面成像，由目镜（Microscope）观察，首先在平面窗口处放置带刻度的分划板，用来标定视野中像的尺寸，便于后续确定空间偏移量。在空间位移拉曼实验中，收集光路保持在中心光轴位置不动以保证收集效率，通过调整光源位置使光源离轴，将激发光源固定到一维精密位移台上，移动位移台（螺纹牙间距小于0.35 mm），相应的窗口处光斑也会偏离光轴，根据分划板的标定使成像视野中激发光光斑偏移中心位置200～1 000 μm，其下限200 μm 用以保证穿透角质层，上限设为1 000 μm，此时像差已经非常明显，且接近视场边缘，不宜继续偏移。

1.2 实验过程

实验目标为7 人，5 男2 女，年龄分布在25～40 岁之间，为增加样本多样性，每人的每个手指分别作为一个样本，则可将样本量扩展到至少70 个。所有受试者手部皮肤健康、光滑无伤疤，无红斑、脱屑。洗洁被测部位后5～10 min（表面水分自然消失）进行测试。实验期间受试部位不可使用护肤品，以避免电解质渗入皮肤，不可使用洗涤剂，以避免破坏角质层，干扰测试结果。测试时将被测位置轻压在平面光学窗口上，保持不动，测量时间为30 s，测试过程需要遮光。

实际测试发现指尖含水量明显高于手掌其它部位，因此对测试部位分组，指尖编为A 组，手指中部编为B 组，大鱼际和指跟编为C 组，编号结果见图2。实验后发现，B 组和C 组的电学法测量受洗手时间和环境湿度影响较大，最终只取A 区结果进行分析。

图2 双手分区编号示意图Fig.2 Numbered partition map of hands

2 结果与讨论

2.1 光谱定量分析

拉曼光谱的横坐标为拉曼位移，单位为波数（cm-1），纵坐标为光谱强度，由于光纤拉曼光谱仪采用了硅基探测器作为光电转换器件，其对光信号强度为线性响应，因此该读数可以用于定量分析［13-14］。

2.1.1 光谱去背景

图3 展示了荧光背景高低不同的三条光谱，需要注意的是这是对同一人同一位置皮肤的三次重复测试，按先后分别对应图中的a、b、c。从拉曼光谱中可以看到无论是中心波数位于3 390 cm-1的水峰还是中心波数位于2 935 cm-1的蛋白峰，光谱1、光谱2 和光谱3 都不重合，其原因主要来源于荧光信号强度随照射时间的衰减，造成了光谱基线不重合，为了保证从三条光谱中得到相同的结果，必须对光谱进行去背景处理［15］。

图3 同一位置重复测试三遍得到的差异性光谱Fig.3 Three different spectra collected from the same location

假设采集得到的拉曼光谱数据集合为Y（i，j），光谱对应的拉曼位移为Xi，i=1～n，n为光谱仪数据点个数，j=1～m，m为拉曼光谱条数。在Xi寻找最接近2 790 cm-1和3 780 cm-1的i值i_2790 和i_3780，对每一条光谱，做计算，即

获得去背景后的光谱集合Y1（i，j）。其中横坐标区域限定在2 790 cm-1到3 780 cm-1段，因为皮肤中与水相关的信息主要集中于此，过多则会增加干扰信息。

2.1.2 计算水峰面积和蛋白质峰面积

在Xi寻找最接近水峰范围边界3 350 cm-1和3 550 cm-1对应的i值i_3350 和i_3550，以及蛋白质峰范围边界2 910 cm-1和2 965 cm-1对应的i值i_2910 和i_2965，使用积分法计算光谱面积有

式中，Wj为水峰面积，Pj为蛋白质峰面积。

2.1.3 根据光谱数据推算皮肤相对含水量

基于拉曼光谱的水含量定量分析采用拉曼波段在3 390 cm-1处的强度和2 935 cm-1处的强度之比确定组织中的水蛋白比例［16］，计算每个样本的含水量Pw，公式为

对于水峰和蛋白质峰，有

式中，mWj为每个样本所对应的水的质量，mPj为每个样本所对应的蛋白质的质量，R为水峰和蛋白质峰的峰面积比例系数。

人体平均含水量为60%，按含水量计算公式

则mW/mP=1.5。据此。

按照以上方法，A 组产生70 个相对水含量，重复三次实验以增加稳定性，对应的三条光谱在正常情况下经过上述算法处理后可以得到重复的结果。图4 为所有70 条光谱的合集，图中右上角为经过去背景处理后的效果。含水量用百分比（%）表示，表1 和表2 分别记录了用电学法和光谱法测得的皮肤含水量数值，其中7 行代表编号为1～7 的7 个受试者，10 列代表每个受试者的10 个测试位置，下文将两组结果做一致性分析。

表1 1-7 号受试者的光谱法结果（%）Table 1 Results of spectroscopic methods for subjects 1-7（%）

表2 1-7 号受试者的电学法结果（%）Table 2 Results of electrical conductivity methods for subjects 1-7（%）

图4 70 条原始光谱以及去背景光谱的集合Fig.4 A collection of 70 original spectra and 70 spectra after baseline calibration

2.2 一致性分析

组内相关系数（ICC）常用于评价不同方法、设备或测试人员对同一定量测量结果的一致性和可重复性［17-18］，ICC=σ2T/(σ2T+σ2B+σ2E)。其中σ2T为被测者变异，σ2B为系统误差（不同测试方法），σ2E为随机误差造成的变异。相关工作由SPSS 方法完成，选择“可靠性分析”功能，调用适用于两项分析的Alpha 模型，α是衡量信度的一种方法，α>0.7 属于高信度，0.35<α<0.70 表示可以接受，α<0.35 属于低信度。

对数据统计时选用组内相关系数，组内相关系数的计算有三种模型，分别是单向随机、双向随机和双向混合。其中，单项随机模型不适用于评价结果的可重复性。双向随机模型与双向混合模型接近，理论上都可用来评价可重复性，其中双向随机模型适用于采用任意同样设备的两个研究者，而双向混合模型的结果仅限于给定的两种设备，不能推论其他。因此，本研究选择双向混合模型。该模型下又分为两种评价类型，分别为一致性和绝对一致，考虑到电学法和光谱法得到的含水量未经过统一标定，因此选择一致性评价方法。计算的结果见表3，结果包含了组内相关系数及其95%置信区间，其中单个测量（Single measurement）可以估计单个设备的可靠性，平均测量（Average measurement）为两者的平均值。由单个测量组内相关系数为0.889 可以看出，两种方法的检测结果有较高的一致性，但基于空间拉曼光谱法的检测装置对皮肤的清洁要求并不严格，应用更加便利。

个体的差异使信号来源并不一致，例如若甲比乙的角质层厚，则甲的信号很可能来自上层水含量低的位置而乙的信号来自下层水含量高的位置，这使两人含水量的对比失去意义。幸运的是，皮肤中水含量稳定的储水层具有足够的厚度，这使本研究可以找到一个适合的探测参数，使每个人的信号来源既不过浅，又不过深，即位于甲和乙能代表总体含水量的区域的重叠位置，基于此建立一种适用于多数人的含水量比较方法。

找到适合大多数人的适宜深度是消除差异性的关键，假设人体的差异体现到空间位移距离上小于800 μm，从200 μm 到1 000 μm 的范围内做了4 组对比实验，用来探索效果最佳的探测参数。如图5 所示，本文设置了4 种不同空间位移量的实验，图5 中（a）～（d）对应的空间位移距离分别为200 μm、300 μm、500 μm和1 000 μm，每个光谱都连续的重复测量3 次，用以展示荧光衰减后光谱强度的分布范围。不同空间位移量下测得的来自同一人同一位置的皮肤光谱，可以看到只在信号强度上有明显区别，而在光谱轮廓和细节上没有显著和规律的变化，无法区别哪种光谱的效果更好，只能依靠定量分析的结果来判断。本文在4 种空间位移量下分别重复了上文所述的实验和分析过程，最终确认了空间位移量为300 μm 时可以得到最佳的效果。

图5 在不同空间位移量下测得的拉曼光谱Fig.5 Raman spectra at different spatially offsets

用统计学的方法证明该装置具有空间灵敏性并且得到最优的装置参数后，我们也希望总结出一种更直观的通过光谱特征快速的判断信号优劣的方法，图5 为在不同空间位移量下测得的拉曼光谱，依旧是连续采集三条光谱以保证光谱典型性，从表4 可以看出随着空间位移距离的增大，光谱高度依次降低，但一致性却随着光谱高度的递减呈现先升高后降低然后再升高的趋势，并没有什么规律，因此不能从光谱高度来判断信号优劣。我们注意到即使是同一个人的同一个位置，水信号相对强度（拉曼波数在3 390 cm-1和2 935 cm-1处的强度之比）在不同空间位移距离的检测条件下，其值也是不相等的，原因在于皮肤并非所有的深度都能正确的体现含水量。表4 展示了不同空间位移下获得的数据的组内相关系数以及相对水峰强度。总体而言，如果水信号相对强度小于0.05，那么检测结果就只有低可信度，例如实验中空间位移距离为500 μm 时，水信号相对强度只有0.023，组内相关系数只有0.316，这种条件下就需要调整光路，或者检查被测人皮肤是否有损伤、疤痕等问题；如果水信号相对强度接近0.10，即可判断此时的光路配置基本合格，只需要进一步细调，以确定最佳参数，该经验方法可以快速有效的对弱信号、强背景光谱进行筛选，提高研究效率。

表4 不同空间位移对应的组内相关系数Table 4 ICC for different spatially offsets

3 结论

本文探索了基于空间位移拉曼光谱和便携式光纤光谱仪检测皮肤含水量的可行性，搭建了精密的空间位移拉曼光谱装置并用统计学的方法证明了该装置具有空间灵敏性。实验装置设计了可微移的光源，利用光源与激发点的共轭关系调节空间位移量，同时引入显微成像光路控制调节，最终实现了小于1 000 μm 的空间位移量的连续可调，在不同空间位移距离下采集了一系列人体光谱，经过光谱去背景、水相对含量分析等算法的处理，得到了稳定的相对水含量，证明该实验装置可以得到重复性良好的光谱。通过对电学法和光谱法测试结果的对比统计分析得到组内相关系数，当空间位移距离分别为200 μm、300 μm、500 μm 和1 000 μm 时，对应的组内相关系数分别为0.612、0.889、0.316 和0.544。确定了适用于人体皮肤含水量检测的最优空间位移量为300 μm，在该条件下基于空间位移拉曼光谱测得的人体活体皮肤含水量结果与电学法检测结果具有较高一致性，同时不需要电学法严格的皮肤清洁过程，有望实现皮肤内层水含量的便捷检测。光纤光谱仪和探测探头分离的设计也满足实用化的要求，便于展开大量人体测量实验，有转化成医疗器械的潜能。