基于Wnt/β-catenin 信号通路探讨四君子汤对胃癌脾气虚证裸鼠的作用机制*

陈 成，付 越，李 亮，李 丰

湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

胃癌是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，对人类健康和安全构成严重威胁。根据国际癌症研究机构（IARC）最新统计，2020 年全球大约76.3 万人死于胃癌，在恶性肿瘤发病率排名第五，死亡率排名第四［1］。东亚、东欧和南美是胃癌高发的重点地区［2］。其发生发展是一个多因素掺杂、存在多个阶段的复杂病理过程。临床实践和科学研究发现中医药在治疗癌症方面具有确切疗效［3］。四君子汤源自《太平惠民和剂局方》。LI等［4］研究发现四君子汤可整合增强非替尼抗癌的调节特性，提示四君子汤可能在癌症治疗中发挥作用。LUO 等［5］通过高通量组学研究发现四君子汤可通过上调MicroRNA 表达改善胃癌症状，其靶基因中关系最为密切的通路是Wnt/β-catenin。Wnt/β-catenin 是一个高保守的信号通路，大量证据证明其参与了肿瘤的增殖、分化、迁移和侵袭过程［6］。因此，这一分子途径在癌症靶向治疗中具有重要意义。有研究揭示脾气虚证在胃癌的整个病程中具有重要作用［7］。四君子汤为治疗脾气虚证的代表方，但四君子汤能否通过调节Wnt/β-catenin发挥作用的机制仍不明确。

前期研究发现四君子汤对胃癌脾气虚证具有改善作用［8］，四君子汤通过作用于血浆和唾液的共同靶基因miR-151a-3 调控胃癌脾气虚证的发生、发展。因此，基于前期研究基础，本研究以Wnt/β-catenin 信号通路为切入点进一步探讨四君子汤对胃癌脾气虚证的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 细胞人胃癌NCI-N87 细胞购自北纳生物制品公司（质检编号：338548）。

1.2 实验动物BALB/c 雄性裸鼠25 只，4～6 周龄，体质量（16±4）g，湖南中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（湘）2019-0009，饲养在湿度（50±10）%和温度（22±2）℃的环境下，实验方案已通过动物伦理委员会批准，伦理编号：LL2020061501）。

1.3 药品、试剂与仪器

1.3.1 四君子汤 由人参12 g、白术12 g、茯苓12 g 和甘草6 g 组成，购于辽宁龙参健康药业有限公司（批号：200905），经湖南中医药大学药学院袁林祥教授鉴定合格。四君子汤药液制备：以10倍水充分浸泡中药2 h，回流提取2 次，转移至旋转蒸发仪，75 ℃蒸发浓缩成2 g/mL 的药液于-20 ℃冰箱保存。灌胃时水浴加热至37 ℃。

1.3.2 番泻叶 购于湖南中医药大学第一附属医院（批号：201019），以10倍水充分浸泡30 min，回流提取2 次，转移至旋转蒸发仪，75 ℃蒸发浓缩成1 g/mL的药液于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 主要试剂 RPMI-1640 培养基（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0215-Feb-16G2）；BI特级胎牛血清（Biological Industries 公司，批号：04-001-1ACS）；超纯总RNA 提取试剂盒（新景生物试剂开发有限公司，批号：5003050）；BCA 蛋白定量试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，批号：E-BC-K318-M）；ECL 发光液（Biosharp 公司，批号：BL520B）；RIPA 蛋白裂解液（批号：CW2333s）、蛋白磷酸酶抑制剂混合物（批号：CW2383S）；SDSPAGE上样缓冲液（批号：CW0027S）均购自康为世纪科技有限公司；Wnt1、β-catenin、C-myc、Mmp-7、Gsk-3β、GAPDH 抗体（武汉三鹰生物技术科技有限公司，批号分别为：27935-1-AP、66379-1-Ig、67447-1-Ig、10374-2-AP、22104-1-AP、10494-1-AP）；山羊抗兔免疫球蛋白、山羊抗鼠免疫球蛋白（伊莱瑞特生物科技有限公司，批号分别为E-AB-1003、E-AB-1001）。

1.3.4 主要仪器 细胞培养箱（Thermo 公司）；低温高速离心机（长沙维尔康）；varioskan LUX酶标仪（Thermo 公司）；蛋白电泳仪、蛋白表达成像系统、580BRMy-CyclerPCR 仪、ChemiDocXRS+凝胶成像分析系统均美国Biorad公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制备

1.4.1.1 脾气虚证制备 将20 只裸鼠分为正常组6 只、模型组14 只，正常组常规喂养，灌胃蒸馏水；模型组灌胃番泻叶结合饥饱失常法制备脾气虚证模型，番泻叶药液（1 g/mL）按每日10 mL/kg剂量灌胃，灌胃后禁食12 h，再恢复足量喂食，共15天。

1.4.1.2 人胃癌裸鼠原位移植瘤模型制备［9］另取5 只4～6 周龄BALB/c 雄性裸鼠，将NCI-N87 人源胃癌细胞悬液（2×106/mL）接种于裸鼠腋下，培育胃癌组织块。观察裸鼠腋下种植瘤生长情况，长到直径10 mm 左右剥取出来，作为原位移植瘤的癌源。脱颈处死癌源裸鼠，剥取腋下肿瘤，清理瘤体上的包膜纤维和残留血管等，PBS 溶液冲洗呈鱼肉状，剪成1 mm 大小瘤体，将瘤体种植于脾气虚证裸鼠胃体上，用无菌针头轻微挑破胃大弯中部皮下筋膜，微微渗血即可，将制备好的瘤体用OB 胶粘贴于筋膜划破处，医用胶凝固定，粘牢瘤体，分层关闭腹腔，整个操作过程要迅速、保温，严格遵守无菌原则。

1.4.2 动物分组、干预及样本采集 将造模成功的模型组（14 只）中裸鼠随机挑选7 只（四君子汤组）灌胃四君子汤（10.92 g/kg），每日1 次，剩余裸鼠仍记为模型组。模型组、正常组灌胃蒸馏水。于造模后14天末，禁食禁水12 h，处死裸鼠，打开腹腔，分离剥取模型组和四君子汤组裸鼠胃癌组织。测量肿瘤质量，置于无菌冻存管-80 ℃冰箱保存。

1.5 观察指标及测定方法

1.5.1 中医行为学表征及体质量 造模后，每日清晨8 点密切观察3 组裸鼠精神状态、皮肤色泽、反应力、活动度及肛门、粪便状态［10］等行为学表征，每3天测量裸鼠体质量。

1.5.2 瘤体体积及抑瘤率 末次给药后处死裸鼠，称重肿瘤组织，计算肿瘤生长抑制率（抑瘤率）。

抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%

1.5.3 肿瘤组织Wnt/β-catenin 相关蛋白表达检测（Western blot法） 将-80 ℃冰箱中的肿瘤组织取出，称重，在研磨器中加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上低温研磨，离心取上清，用BCA试剂盒测定胃癌组织蛋白浓度，配上样缓冲液，于-20 ℃保存。剩余原液置-80 ℃保存。电泳条件：160 V，30 min，400 V，90 min。PVDF膜湿转400 mA，1 h。5%脱脂奶粉摇床封闭90 min，TBST冲洗干净牛奶后孵育一抗Wnt1 抗体（1∶1000）、β-catenin 抗体（1∶30000）、C-myc 抗体（1∶30000）、Mmp-7 抗体（1∶5000）、Gsk-3β 抗体（1∶4000）4 ℃过夜，TBST 清洗4 次，每次8 min，37 ℃孵育二抗（兔抗1∶10000，鼠抗1∶10000）1 h，TBST 清洗4 次，8 min，ECL 显影液于凝胶成像系统中显影成像，Image J 软件分析图像。

1.5.4 Wnt1、β-catenin、C-myc、Mmp-7 和Gsk-3β的mRNA表达检测（qPCR法） -80 ℃冰箱取出肿瘤组织称重，TRIzol法提取胃癌组织RNA，测其浓度，按照1000 ng每20 μL逆转录成cDNA，使用SYBR染料，检测Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β的mRNA 表达（qPCR），以GAPDH 为内参，用2-ΔΔCt法计算各mRNA相对表达量。各引物序列见表1。

表1 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β引物序列

1.6 统计学方法采用SPSS 26.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠脱落情况手术种瘤后，模型组死亡1只，四君子汤组死亡1只。

2.2 裸鼠中医行为学表征正常组裸鼠活动度正常，皮毛柔顺有光泽，反应灵敏、大小便正常；模型组裸鼠精神萎靡不振，反应迟钝，弓背懒动，皮毛杂乱，肛门红肿且湿润，大便呈溏状；四君子汤组裸鼠精神状态改善，活动度提高，反应尚佳，无明显弓背懒动现象，皮肤光泽度尚可，泄泻情况改善，粪便数量减少并趋于正常，肛周未见红肿，便质变硬，呈黑褐色。

2.3 裸鼠体质量正常组裸鼠体质量呈平稳上升趋势；与正常组相比，不同时间段模型组、四君子汤组体质量降低（P＜0.05）。与模型组相比，第19 天开始，四君子汤组体质量增加（P＜0.05）。见表2。

表2 不同时间段3组裸鼠体质量比较（±s）g

表2 不同时间段3组裸鼠体质量比较（±s）g

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别正常组模型组四君子汤组第28天25.56±0.62 18.28±0.37*21.63±0.42*#鼠数6 6 6第16天24.17±0.40 20.25±0.54*20.55±0.41*第19天24.43±0.70 19.95±0.47*20.88±0.40*#第22天25.16±0.64 19.48±0.39*21.13±0.34*#第25天25.23±0.74 18.93±0.42*21.33±0.40*#

2.4 裸鼠瘤体质量与模型组相比，四君子汤组瘤体质量减轻（P＜0.05），抑瘤率为47%。见表3。

表3 3组裸鼠瘤体质量比较（±s）g

表3 3组裸鼠瘤体质量比较（±s）g

注：#表示与模型组比较，P＜0.05；-表示无瘤体

组别正常组模型组四君子汤组瘤体质量-0.045±0.0078 0.024±0.0040#鼠数6 6 6

2.5 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β的mRNA 表达与模型组相比，四君子汤组Wnt1、βcatenin、C-myc和Mmp-7的mRNA表达下降（P＜0.05），Gsk-3β的mRNA表达升高（P＜0.05）。见表4。

表4 两组裸鼠Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白mRNA表达结果（±s）

表4 两组裸鼠Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白mRNA表达结果（±s）

注：：#表示与模型组比较，P＜0.05

组别模型组四君子汤组Gsk-3β mRNA 1.53±1.25 2.18±1.16#鼠数6 6 Wnt-1 mRNA 0.72±0.35 0.33±0.12#β-catenin mRNA 1.17±0.80 0.51±0.18#C-myc mRNA 1.16±0.55 0.23±0.17#Mmp-7 mRNA 1.04±0.27 0.47±0.13#

2.6 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7 和Gsk-3β的蛋白表达与模型组相比，四君子汤组Wnt-1、β-catenin、C-myc和Mmp-7蛋白表达降低（P＜0.05），Gsk-3β蛋白表达升高（P＜0.05），见表5和图1。

图1 两组裸鼠胃癌组织蛋白电泳

表5 两组裸鼠Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达（±s）

表5 两组裸鼠Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达（±s）

注：#表示与模型组比较，P＜0.05

组别模型组四君子汤组Gsk-3β 0.65±0.20 1.14±0.28#鼠数6 6 Wnt-1 1.15±0.20 0.56±0.22#β-catenin 1.50±0.77 0.60±0.04#C-myc 1.06±0.19 0.78±0.04#Mmp-7 0.97±0.06 0.75±0.08#

3 讨论

胃癌是一种常见的恶性病质，包括上皮内瘤变、黏膜内癌、黏膜下癌及浸润癌，病因未明，可发生于胃的任何部位［11］。胃癌属中医“反胃”“胃脘痛”“噎膈”“癥瘕”等范畴［12］。中医认为脾胃为后天之本，脾胃受损则元气不充，诸病由生，致积聚结块。现代研究认为胃癌的发生与“虚”“痰”“瘀毒”等因素密切相关，因脾气不足，运化水湿失治，聚湿成痰，进一步加重中焦虚弱，气血化生乏源，血液运行不畅，瘀血由生，痰瘀互结，痰瘀蕴久化毒，最后生成痰瘀毒交结的病理产物［13］。病性是本虚标实，脾胃气虚是胃癌产生的根本，贯穿胃癌早、中、晚期及术后等，健脾益气是治病求本，培本固元［14］。现代药理研究显示，机体的免疫逃逸也是造成肿瘤细胞持续增殖的主要原因，健脾益气法可增强自身免疫［15］。因此可通过培本固元，调节机体阴阳、脏腑、气血、经络平衡，调动人体内的防御机制，抑制肿瘤生长。四君子汤方中人参为君，甘温益气，健脾养胃；臣以白术苦温健脾燥湿，益气助运；佐以甘淡茯苓，健脾渗湿，苓术相配则健脾祛湿之力显著；使以甘草益气和中，调和诸药［16］。慢性萎缩性胃炎是胃癌进程中的重要过程，现代药理研究发现四君子汤可改善胃局部炎症和外周血白细胞炎症，降低慢性胃炎患者胃癌的发生率［17］。四君子汤还可抑制胃癌干细胞GCSCs，通过降低β-catenin 核积累和DNA 结合活性来实现［18］。

Wnt/β-catenin 信号通路也被称为经典或β-catenin 依赖信号通路，是一个保守的信号轴，参与各种生理过程，如细胞生长、分化、凋亡、迁移、侵袭和组织稳态［19］。研究发现Wnt/β-catenin 信号通路与胃癌、肝癌和乳腺癌等多种恶性病质密切相关［20］，其通路的激活依赖于β-catenin 的过度积累和表达。但一种被称为“破坏复合物”的复合物有助于β-catenin 在生理条件下的降解。“破坏复合物”由腺瘤性大肠息肉病、Dishevelled（Dvl）、酪蛋白激酶1 和Axin/Axin2 组成，β-catenin 会导致其被糖原合成酶激酶-3β（Gsk-3β）降解，然而，Dvl 的刺激会“破坏复合体”，从而导致抑癌基因Gsk-3β失活，大量β-catenin在细胞质中积累，并转运至细胞核，与淋巴增强子结合因子和t 细胞因子相互作用，从而活化转录，促进下游靶基因如C-myc 和Mmp-7 等，造成细胞周期调节失控，细胞周期调节失控是恶性肿瘤的重要特征之一，这将对细胞产生灾难性影响［21］。Wnt1是Wnt家族的第一个成员，其在系统发育方面保守，对于肿瘤发生和多种发育过程至关重要。研究发现Wnt1 表达与胃癌大小、分化程度、浸润深度和淋巴结转移及生存率密切相关。正常成熟的胃组织Wnt1信号表现缺如［22］。说明Wnt1可作为胃癌潜在生物标志物的靶标［23］。β-catenin又名B-连环蛋白，是Wnt通路的关键因子，幽门杆菌可激活β-catenin 以促进胃上皮细胞的肠道转分化［24］，β-catenin 及胃癌相关E-钙黏蛋白被证实不仅是黏附连接的静态成分，而且是下游Wnt 信号级联的重要介质，二者可作为胃癌发生和发展的独立危险因素［25］。C-myc基因是MYC基因家族的重要成员之一，C-myc蛋白为细胞程序的主要调节剂，该基因既是可转基因，也是受多种因子调控的调控基因。C-myc通过肿瘤细胞内在机制及宿主免疫和TME 依赖机制启动和维持癌症［26］。Mmp-7 蛋白（又称金属蛋白酶7）属Mmp 家族，参与基底膜和细胞外基质的破坏，导致肿瘤侵袭和转移。LONG等［27］发现Mmp-7与胃癌的分化程度和临床分期密切相关，并提示Mmp-7参与了胃癌组织的侵袭和转移，有望作为确定胃癌进展和预后的有用生物标志物。

本研究结果显示，模型组裸鼠胃癌组织中Wnt1、β-catenin、C-myc 和Mmp-7 蛋白及其mRNA 表达上升，Gsk-3β蛋白及其mRNA 表达下降，四君子汤组Wnt1、β-catenin、C-myc 和Mmp-7 蛋白及其mRNA表达下降，Gsk-3β蛋白及其mRNA表达上升。由此推断，四君子汤可通过影响Wnt 信号通路相关蛋白来影响胃癌脾气虚证裸鼠癌瘤体的生长。预测影响途径可能是上游wnt 配体的调控、关键基因β-catenin 核异位下调和基因表达或影响下游靶基因C-myc和Mmp-7表达，细胞周期调节失控。

综上所述，四君子汤可下调肿瘤因子表达，在一定程度上抑制Wnt/β-catenin 信号通路的激活，减缓胃癌脾气虚证病程。