益脑康胶囊对缺血再灌注模型小鼠自噬相关因子Beclin-1、LC3B 和p62 的影响*

邓敏贞，钟晓琴，高志杰，彭丽霖，程 骁，孙景波△

1 广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院，广东 广州 510120；2 广州中医药大学，广东 广州 510006

脑卒中的病因主要是由于机体脑组织受到急性期或慢性期局部供血不足或供血中断而引起的局灶性损伤，其中缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）占80%，具有发病率高、致残率高和致死率高等特点［1-2］。急性期IS西医主要采用溶栓治疗，具有局限性大和风险性高的特点，容易进一步引发缺血再灌注损伤，多数患者无法获得满意治疗，如超过治疗时间窗或严重肝肾功能不全等禁忌症［3］。由于目前可以改善IS 患者脑循环的西药较少，且毒副作用明显；中医活血化瘀类中药具有改善脑循环作用，能整体调节患者机能，并有助于恢复患者的神经功能，可见中医治疗恢复期IS具有明显优势［4］。

自噬具有各细胞成分更新功能，主要表现在降解及再循环异常的蛋白质或细胞器［5］。研究发现，生理状态下，自噬具有双向调节作用，一定程度的自噬可保护细胞生理功能，但脑缺血再灌注会过度激活自噬，严重者导致神经细胞死亡［6］。还有研究指出，抑制自噬可一定程度减少氧糖剥夺刺激作用下神经元的死亡［7］。益脑康是广东省名老中医刘茂才教授的经验方，是治疗动脉粥样硬化性急性缺血中风的常用院内制剂［8］。研究证明益脑康胶囊具有促进微血管再生，抑制新血管生成，修复损伤的内皮细胞并调节其功能恢复和抑制炎性反应功能［9-10］。本研究通过观察益脑康胶囊对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织及自噬相关因子表达的影响，探讨益脑康胶囊防治缺血性中风的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物C57BL/6 小鼠50 只，雄性，SPF 级，体质量（20±2）g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（粤）2018-0094，饲养于广东省中医药科学院实验动物中心，温度（23±2）°C，相对湿度（45±5）%。小鼠适用性环境饲养3天后进行后续实验。

1.2 药物与试剂益脑康胶囊（广东省中医院院内制剂，批号：180804，规格：0.5 g/粒）；水合氯醛（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10232286，规格：100 g/瓶，纯度≥99.0%）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美国sigma 公司，货号：T8877）；MCAO栓线（北京西浓科技有限公司，货号：1620A4）；Trizol试剂（美国thermo公司，货号：191012）；逆转录反应试剂盒（日本TAKARA 公司，货号：RR047A）；扩增反应试剂盒（日本TAKARA 公司，货号：RR086A）；肌球蛋白样BCL2 结合蛋白（myosinlike BCL2 interacting protein，Beclin-1）、微管相关蛋白1的轻链3B（microtubule associated protein light chain 3B，LC3B）和泛素结合蛋白62（sequestosome 1，p62）ELISA 试剂盒（南京草本源生物科技有限公司，批号：07/2018）。

1.3 仪器ME403 电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；T10 匀浆机（艾卡仪器设备公司）；5804R 冷冻离心机（德国艾本德公司）；EonC 全波长酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；Nanodrop2000 超微量紫外/可见光光度计（美国Thermo 公司）；CFX96 荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 动物造模脑缺血再灌注损伤小鼠模型按照大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法建立［11］。小鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射后仰卧位固定，对颈部手术部位进行备皮消毒，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，颈总动脉暂时阻断血流，然后将颈外动脉结扎并游离。在颈外动脉游离端处剪一小口，将MCAO 线栓由剪口处插入，经颈总动脉拐向颈内动脉的大脑中动脉起始处。栓塞1 h 后拔出线栓（栓塞期间注意小鼠保暖），结扎颈外动脉，形成缺血再灌注损伤模型，颈部切口处结扎缝合。假手术组小鼠按造模方法进行血管分离操作但不插入MCAO线栓。

1.5 分组与给药造模结束小鼠苏醒后，将神经评分不小于1 的小鼠随机分为模型组及益脑康低（1 g/kg）、中（3 g/kg）、高（9 g/kg）剂量组，每组10 只，连续灌胃给药3 天，每天2 次。假手术组和模型组小鼠（各10 只）给予等体积生理盐水，连续3天，每天2次。

1.6 观察指标

1.6.1 脑梗死体积 采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法，末次给药结束后，小鼠麻醉过量致死，将脑迅速取出，置于预冷脑槽中以每片2 mm 厚度进行冠状切片，将切片置于TTC 溶液中37 ℃浸泡30 min，每15 min 翻转切片1 次，其中白色部分为脑梗死区域，正常组织染色为红色。用照相机拍照后，再用Image J软件进行分析。

脑梗死体积比例（%）=白色脑梗死体积/大脑体积×100%

1.6.2 神经损伤情况 末次给药结束后对各组小鼠进行神经行为学评分［11］，评分标准：0 分行动自如，无明显功能障碍；1 分造模对侧前肢不能伸展，如握拳状；2 分向健侧旋转圈，呈追尾状；3 分行走身体倾倒；4分无行动欲望伴意识障碍。

1.6.3 Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA 和p62 mRNA表达 实时荧光定量聚合酶链式（real-time PCR，RT-PCR）法检测半暗带区域组织Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA 和p62 mRNA 表达。将各组小鼠的第2 个脑片半暗带区组织，按100 mg 重量加入1 mL Trizol 比例提取总RNA。测量总RNA 浓度后，使用逆转录试剂盒在以下条件下合成cDNA：42 ℃ 2 min，温度降至4 ℃取出。按扩增试剂盒操作在CFX96 PCR仪中进行RT-PCR，PCR反应条件：95 ℃ 1 min，40 个循环的95 ℃ 10 s 和60 ℃ 30 s。用2-△△Ct 数值表示目的基因相对表达量。引物序列由广州真知生物有限公司设计与合成，引物序列：

Beclin-1：上游5'-GCTGTAGCCAGCCTCTGAAA-3'，下游5'-AATGGCTCCTGTGAGTTCCTG-3'，长度80 bp；

LC3B：上 游5'-GGGACCCTAACCCCATAGGA-3'，下游5'-TCTCCCCCTTGTATCGCTCT-3'，长度111 bp；

p62：上游5'-ACTGCTCAGGAGGAGACGAT-3'，下游5'-CCGGGGATCAGCCTCTGTAG-3'，长度77 bp；

β-actin：上游5'-CACTGTCGAGTCGCGTCC-3'，下游5'-CGCAGCGATATCGTCATCCA-3'，长度102 bp。

1.6.4 半暗带区组织Beclin-1，LC3B和p62含量检测 酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测半暗带区组织Beclin-1，LC3B 和p62 含量。将各组小鼠第3 个脑片半暗带区组织，按100 mg重量加入9 mL生理盐水进行冰上匀浆，经离心半径10 cm，3500 r/min 15 min 低温离心后得上清液，按ELISA 试剂盒步骤操作，最后在450 nm处检测各组吸光度。

1.7 统计学方法采用SPSS 22.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠脑梗死（缺血区域）体积与假手术组比较，模型组小鼠缺血区域体积增加（P＜0.01）；与模型组比较，益脑康各剂量组小鼠缺血区域体积减少（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠脑梗死（缺血区域）体积比例（±s）

表1 各组小鼠脑梗死（缺血区域）体积比例（±s）

注：与假手术组比较，**表示P＜0.01；与模型组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等体积生理盐水

脑梗死（缺血区域）体积比例（%）组别鼠数剂量（g/kg）3.00±0.35 45.62±3.65**38.62±2.53**#30.60±2.06**##21.65±1.36**##假手术组模型组益脑康低剂量组益脑康中剂量组益脑康高剂量组10 10 10 10 10--1 3 9

2.2 小鼠神经损伤情况与假手术组比较，模型组小鼠神经损伤程度增加（P＜0.01）；与模型组比较，益脑康各剂量组小鼠神经损伤程度减少（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠神经评分（±s）

表2 各组小鼠神经评分（±s）

注：与假手术组比较，**表示P＜0.01；与模型组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等体积生理盐水

神经评分（分）0.00±0.00 3.20±0.16**2.00±0.11**#1.80±0.09**#1.40±0.10**##组别假手术组模型组益脑康低剂量组益脑康中剂量组益脑康高剂量组鼠数10 10 10 10 10剂量（g/kg）--1 3 9

2.3 小鼠半暗带组织Beclin-1 mRNA、LC3B mRNA和p62 mRNA 表达与假手术组比较，模型组小鼠Beclin-1 mRNA 和LC3B mRNA 增加（P＜0.01），p62 mRNA减少（P＜0.01）；与模型组比较，益脑康各剂量组小鼠Beclin-1 mRNA和LC3B mRNA减少（P＜0.01），p62 mRNA增加（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠半暗带组织Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA和p62 mRNA表达（±s）

表3 各组小鼠半暗带组织Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA和p62 mRNA表达（±s）

注：与假手术组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与模型组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等体积生理盐水

组别假手术组模型组益脑康低剂量组益脑康中剂量组益脑康高剂量组p62 mRNA 1.03±0.04 0.30±0.03**0.42±0.03**#0.57±0.05**##0.84±0.08*##鼠数10 10 10 10 10剂量（g/kg）--1 3 9 Beclin-1 mRNA 1.02±0.51 12.32±1.55**7.67±0.46**##6.14±0.42**##4.27±0.50**##LC3B mRNA 1.00±0.11 10.58±0.61**6.33±0.60**##4.19±0.38**##2.34±0.19**##

2.4 小鼠半暗带组织Beclin-1，LC3B和p62蛋白含量与假手术组比较，模型组小鼠Beclin-1 和LC3B 蛋白含量增加（P＜0.01），p62 蛋白含量减少（P＜0.01）；与模型组比较，益脑康各剂量组小鼠Beclin-1和LC3B蛋白含量减少（P＜0.01），p62蛋白含量增加（P＜0.01）。见表4。

表4 各组小鼠半暗带组织Beclin-1，LC3B和p62蛋白含量（±s）

表4 各组小鼠半暗带组织Beclin-1，LC3B和p62蛋白含量（±s）

注：**表示与假手术组比较，P＜0.01；##表示与模型组比较，P＜0.01；-表示等体积生理盐水

组别假手术组模型组益脑康低剂量组益脑康中剂量组益脑康高剂量组p62（ng/g）90.56±5.50 21.29±2.75**36.11±1.95**##52.59±2.65**##64.43±3.47**##鼠数10 10 10 10 10剂量（g/kg）--1 3 9 Beclin-1（ng/g）8.54±0.65 43.04±2.76**30.23±1.35**##22.35±1.68**##15.12±0.74**##LC3B（ng/g）12.55±0.81 67.50±3.75**55.62±3.01**##43.46±2.53**##30.29±1.64**##

3 讨论

脑卒中通常与严重神经功能下降和死亡率有关，其高致残率为患者带来了沉重的经济和社会负担［12］。IS 是脑卒中死亡的首要原因，其发病机制尚不明确［13］。中药复方具有多靶点、多成分、多机制的特点，治疗脑缺血具有较好的疗效［14-15］。益脑康胶囊被列入国家科技部“十五”攻关课题“急性缺血中风辨证规范与疗效评价的示范研究”中医综合方案［16］。但益脑康胶囊对脑卒中的作用机制尚不明确，因此本研究探讨益脑康胶囊对IS 模型小鼠的作用机制。

中风事件大多归因于大脑中动脉阻塞，最近研究说明较为理想的局灶性脑缺血模型是采用线栓法制备的小鼠局灶性脑缺血模型，有利于脑血管疾病的基础研究［17］。TTC 是一种无色水溶性染料，主要在活细胞的线粒体中还原为深红色水不溶性化合物（甲酰胺），用TTC 对新鲜脑切片进行浸没染色是实验性卒中模型中检测梗死的一种简单且流行的方法，可区分中风后的存活和梗死的脑组织［18］。本研究发现，模型组小鼠脑梗死体积较假手术组明显增加，神经功能评分升高，提示造模成功。益脑康各剂量组小鼠神经功能评分较模型组减少，提示益脑康胶囊对IS 模型小鼠有较好保护作用。

自噬是维持细胞内环境稳态的生理过程，其中Beclin-1 是自噬的调控基因和特异性基因，它是自噬启动的关键因子，关键蛋白是LC3，具有控制自噬膜形成和自噬体与溶酶体融合的功能，LC3B 的产生是自噬的标志，能间接反映自噬程度与水平，其含量与自噬强度呈正相关［19-20］。p62是能在自噬溶酶体内发生降解可特异性识别泛素化的蛋白，研究发现其表达水平的高低与自噬水平呈负相关［21］。本研究表明，通过线栓法制备的局灶性脑缺血模型小鼠的Beclin-1 和LC3 表达增加，p62表达减少，提示IS自噬程度显著增加。益脑康胶囊各剂量组小鼠Beclin-1 和LC3 表达减少，p62 表达增加，提示益脑康胶囊有一定减缓自噬激活的作用。

综上所述，益脑康胶囊对IS 模型小鼠具有神经保护作用，其机制主要是抑制自噬过度激活，表现为减少Beclin-1 和LC3 表达及增加p62 表达。这可为益脑康胶囊的进一步临床研究和基础研究提供依据。