益气养阴活血法对特发性肺纤维化大鼠血管新生的影响*

陈 炜，张念志，胡梦娟

安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的以肺间质纤维化改变为主的慢性疾患，临床发病率呈增长趋势。其起病隐匿，病因、病机尚不明确，目前尚无有效治疗方法，病死率高，IPF 确诊后平均生存时间约3～5 年［1］。临床常见的死亡原因多为IPF 患者生理指标的急性恶化、感染、突发呼吸衰竭、心脏衰竭、急性冠状动脉综合征、静脉血栓栓塞性疾病等［2］。

IPF患者存在广泛血管新生现象，血管新生是受促血管新生因子和抑制血管新生因子动态平衡调控，当肺组织受损，该平衡被打破，血管新生［3］。常见的促血管生长因子包括血清低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）；色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）和内皮生长抑制素（endostatin，ES）为血管新生抑制因子。当促血管生长因子分泌增加，动态平衡失衡，大量血管新生形成，加重肺纤维化；血管新生抑制因子高表达，则血管新生抑制，从而改善毛细血管通透性及肺部微循环，改善缺氧状态，抑制IPF 进一步发展［4］。血管新生已成为IPF防治的新靶点。

IPF 属中医“肺痿”范畴。笔者根据IPF 患者的中医证候学特点，提出“肺失治节，因虚致瘀”理论。以肺肾气阴两虚为本，痰瘀阻滞肺络为标，故提出益气养阴活血法。本课题在既往研究的基础上，探讨益气养阴活血法对IPF 大鼠血管新生相关因子的影响，明确调控靶点及其干预机制。

1 资料与方法

1.1 动物SPF 级雄性SD 大鼠128 只，体质量（260±20）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（鲁）2014-0007。大鼠于安徽中医药大学第一附属医院实验中心动物房饲养。

1.2 药品醋酸泼尼松片剂（浙江仙琚制药股份有限公司；批号：20180407，规格：5 mg/片）；参七虫草方（西洋参15 g，三七10 g，冬虫夏草3 g）来自安徽中医药大学第一附属医院中药房。盐酸博来霉素（125 mg，invitrogen，批号：1935037）。

1.3 分组、造模及给药将128 只大鼠随机分为空白组、模型组、泼尼松组、参七虫草组，每组32只，每组4 笼大鼠，一笼8 只。采用气管滴注法造模［5］：10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔内注射，将大鼠仰卧固定于鼠板上，剪去颈毛，皮肤消毒。在颈部中间做一长约1 cm切口，分离暴露气管。用弯眼科钳稍微抬高气管，将含有5 mg/mL 的博来霉素（5 mg/kg）注射器针头经两软骨环穿刺进气管快速给药，将大鼠直立并反复旋转8～10次。无菌操作缝合表皮。空白组以同样方法注射等量生理盐水造模。空白组、模型组均灌胃生理盐水（1 mL/kg·d），泼尼松组灌胃泼尼松混悬液（3.5 mg/kg·d），参七虫草组灌胃参七虫草方汤剂（0.38 g/kg·d）。各组大鼠造模后第2天开始给药，连续28天。

1.4 取材与标本采集分别于造模后第7、14、21、28 天取材。先将大鼠腹腔麻醉，暴露腹腔腹主动脉，收集大鼠腹主动脉血样本，静置2 h，离心半径10 cm，3000 r/min 离心10 min 收集上清液，-80 ℃冰箱保存备用。大鼠处死后迅速打开胸腔，分离肺组织，取左肺下叶固定于10%福尔马林溶液中备用。

1.5 指标检测

1.5.1 大鼠一般状态 观察大鼠反应、呼吸状态、毛发、死亡情况等。

1.5.2 肺组织病理切片及血清HIF-1α、PDGF、PEDF、ES 检测 病理切片制作：从固定液中取出肺组织，切块（2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm），再在固定液中固定2 h，后用不同浓度乙醇脱水，脱水后的肺组织分别用二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，透明后浸蜡、包埋、切片，最后展片、贴片。HE 染色：将制备好的切片脱蜡、复水，然后苏木精染色，乙醇分化见颜色变浅，漂洗，返蓝，乙醇脱水，伊红复染，再次脱水，最后二甲苯透明封片。Masson 染色：将返蓝后的切片（步骤同HE 染色）用丽春红品红染色液染色，再亮绿染色、增鲜、脱水、透明封片。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法应用SPSS 21.0 统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料用±s表示，方差齐采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状态空白组大鼠反应灵敏，活泼好动，呼吸正常，无爪甲紫绀，毛发光泽。模型组大鼠反应迟钝，呼吸急促，有痰鸣音，口鼻可见大量分泌物，爪甲紫绀，毛发枯槁，舌质紫暗。泼尼松组大鼠及参七虫草组大鼠反应及呼吸状态等优于模型组，参七虫草组状态更佳。实验中模型组死亡4只，泼尼松组死亡3只，参七虫草组死亡2只。

2.2 HE染色结果造模后第7、14、21、28天空白组大鼠肺组织结构完整，模型组大鼠肺泡间隔逐渐增宽，间质内炎性细胞逐渐减少，第21 天炎性细胞较第14天少，第28天几乎未见炎性细胞。参七虫草组、泼尼松组病理改变与模型组相似，但程度较轻，以参七虫草组程度最轻。见图1。

图1 各组各时间段大鼠肺组织病理学观察（HE，×400）

2.3 Masson 染色结果造模后，空白组大鼠肺泡间隔未见蓝染区，模型组大鼠肺泡间隔均可见染成蓝色的胶原纤维沉积，颜色逐渐加深，蓝色区域面积逐渐增大，甚至整个显微镜视野下均为蓝染区；与模型组相比，泼尼松组、参七虫草组蓝染区面积较小，颜色较浅，纤维化程度较轻，参七虫草组改善最明显。见图2。

图2 各组各时间段大鼠肺组织病理学观察（Masson，×400）

2.4 ELlSA法检测结果

2.4.1 大鼠血清HIF-1α表达 造模后，与空白组比较，模型组、泼尼松组、参七虫草组HIF-1α含量均增高（P＜0.01）；与模型组比较，相同时间点泼尼松组与参七虫草组HIF-1α含量降低（P＜0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清HlF-1α表达（±s）ng/L

表1 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清HlF-1α表达（±s）ng/L

注：*表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.01；#表示与泼尼松组比较，P＞0.05

组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组第28天18.23±0.64 36.14±0.81*27.81±0.63*△27.05±0.81*△#鼠数32 28 29 30第7天10.65±0.53 25.41±0.54*23.48±0.75*△22.11±1.28*△#第14天15.57±0.96 30.50±0.34*25.13±1.65*△23.77±0.55*△#第21天17.26±1.85 33.51±0.42*27.19±1.57*△26.16±0.59*△#

2.4.2 大鼠血清PDGF表达 造模后，不同时间点与空白组比较，模型组、泼尼松组、参七虫草组PDGF含量升高（P＜0.01）；与模型组相比，泼尼松组与参七虫草组PDGF 表达降低（P＜0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清PDGF表达（±s）ng/L

表2 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清PDGF表达（±s）ng/L

注：*表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.01；#表示与泼尼松组比较，P＞0.05

组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组第28天13.25±2.69 37.90±5.73*26.06±3.35*△22.98±1.50*△#鼠数32 28 29 30第7天23.41±2.35 52.32±6.27*37.20±3.75*△34.28±1.72*△#第14天21.86±2.10 40.75±4.27*29.98±3.48*△28.811±1.79*△#第21天15.19±0.13 38.36±5.54*28.03±4.37*△23.98±1.26*△#

2.4.3 大鼠血清PEDF 表达 造模后，各时间点，模型组、泼尼松组、参七虫草组PEDF 含量高于空白组（P＜0.01）；与模型组相比，同时间点泼尼松组、参七虫草组PEDF 表达升高（P＜0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清PEDF表达（±s）ng/L

表3 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清PEDF表达（±s）ng/L

注：*表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.01；#表示与泼尼松组比较，P＞0.05

组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组第28天25.69±3.17 35.59±2.06*81.72±8.60*△90.77±11.61*△#鼠数32 28 29 30第7天22.56±3.37 59.06±9.55*94.61±11.31*△105.20±9.62*△#第14天23.75±1.47 57.10±8.81*91.29±11.92*△102.92±9.23*△#第21天24.58±2.01 48.89±4.82*89.15±5.94*△98.00±8.45*△#

2.4.4 大鼠血清ES 表达 造模后，各时间点，与空白组比较，模型组、泼尼松组、参七虫草组ES含量上升（P＜0.01）；与模型组比较，同时间点泼尼松组、参七虫草组ES 表达升高（P＜0.01）；泼尼松组与参七虫草组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清ES表达（±s） μg/L

表4 各组大鼠干预第7、14、21、28天血清ES表达（±s） μg/L

注：*表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.01；#表示与泼尼松组比较，P＞0.05

组别空白组模型组泼尼松组参七虫草组第28天84.63±5.82 121.07±10.26*151.49±12.63*△161.38±11.78*△#鼠数32 28 29 30第7天75.94±4.88 136.84±11.81*174.12±10.40*△180.98±11.67*△#第14天81.05±6.99 133.98±11.07*168.14±15.99*△174.19±13.51*△#第21天82.18±6.88 129.23±9.80*160.08±14.83*△169.43±22.44*△#

3 讨论

肺泡上皮损伤与修复是IPF 发展过程中的重要组织病理改变。血管新生是机体愈合的重要组成部分，是肺组织广泛受损后机体修复的最初环节，而异常血管新生是肺部组织形成肺纤维化的重要驱动力。研究发现，IPF 中微纤维化区毛细血管的密集程度较严重纤维化区域程度高，成纤维细胞中无血管组织分布，表明IPF 早期血管新生程度较高，如果在肺部组织受损的早期能阻断异常血管新生，或许能够减轻肺纤维化发展，可为治疗IPF提供新理念［5］。

HIF-1α是机体调节氧平衡重要的氧敏感因子，其与正常细胞代谢、增殖、分化关系密切，也与炎症反应、血管新生密切相连［6］。肺纤维化过程中主要的病理特点是机体缺氧，而HIF-1α是调控机体氧缺乏应激的“开关”，当机体血氧饱和度降低时，HIF-1α高分泌，导致下游VEGF高表达，进而导致血管生成因子表达增加，新血管形成，促进肺纤维化［7］。PDGF 是一种潜在转化生长因子，能使多种间质细胞增殖与趋化，通过促使这些细胞增殖、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表达，诱导血管新生。在机体修复过程中，因肺组织上皮细胞受损，缺血、缺氧，PDGF 高表达，促使损伤的肺组织血管内皮细胞分泌大量VEGF，促进组织再血管化［8］。

PEDF 是一种血管新生抑制因子，研究发现在人和动物的成纤维化细胞中可见PEDF 高表达，同时伴有VEGF 表达降低［9］。ES 是广泛存在于血管外周基底膜的血管生成抑制剂，通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移，促进内皮细胞凋亡从而抑制新生血管形成［10］。研究发现，与正常组比较，肺损伤患者肺泡灌洗液中ES表达水平升高，提示ES参与损伤肺组织的修复过程［11］。

IPF 多归于中医“肺痿”范畴，肺主治节，治理调节全身气、血、津液及脏腑生理功能［12-13］。IPF为肺脏慢性虚损疾患，病机多为本虚标实，本虚责之于肺气虚，肺失治节则气不化津且失于输布，痰浊内生，痹阻肺络；然肺为气之主，肾为气之根，肾主摄纳，乃为水脏，久则母病及子，由肺及肾，且肺肾乃金水滋生之脏，病久必然伤及肾阴，耗损肾气，导致肺肾气阴两虚。标实责之于瘀血内阻。肺主气，朝百脉而主治节，现肺气虚，肺失治节，一则运血无力，另则化津不足，阴虚津亏，血脉失养，脉络不畅，则滞而留瘀，痹阻肺络。虚瘀互结，日久肺脏虚损，津气耗伤，失却濡润以致肺叶枯萎。总之，肺肾气阴两虚是本病产生的内在基础，而肺失治节，因虚致实，瘀血阻滞肺络是其主要病理因素［14］。院内制剂参七虫草胶囊以益气养阴活血立法，其中西洋参为君，益气养阴，清热生津，能够补益肺肾气阴两虚，并祛虚火；冬虫夏草为臣，补益肺肾，化痰止血，《药性考》载：“甘味性温，秘精益气，专补命门”；佐以化瘀止血之要药三七，止血不留瘀，化瘀不伤正，诸药合用，标本同治。

前期研究发现参七虫草胶囊能调整IPF 大鼠血清Th1/Th2 细胞因子失衡；抑制肺泡上皮细胞间质转化过程和MMP-9 与TIMP-1 表达，减轻IPF大鼠肺组织炎症及病理改变；改善免疫蛋白、血液流变部分指标、降低TGF-β1与外周血骨桥蛋白表达，延缓肺功能恶化，改善患者生活质量［15-16］。

本研究结果显示模型组血清PDGF、PEDF、ES含量早期分泌旺盛，后期逐渐减少，HIF-1α后期升高，可能与IPF 患者后期严重缺氧有关，表明在IPF 早期，肺泡壁不仅发生炎症反应，还伴随胶原纤维沉积、血管新生，早期炎症反应与血管新生表达旺盛。炎症是机体损伤后的应激反应，血管新生是肺组织纤维化修复的重要影响因素。与模型组比较，参七虫草组促血管生长因子分泌减小，血管新生抑制因子升高，HE 染色、Masson 染色示参七虫草组大鼠炎症反应及纤维化程度低于模型组。

本研究结果显示，参七虫草组促血管生长因子含量降低，抑制因子表达旺盛，表明参七虫草方可能通过抑制促血管新生因子分泌、促进血管抑制因子表达而干预血管新生，从而达到延缓肺纤维化的目的。