基于GEO 芯片探究槲皮素对银屑病外周血中性粒细胞的分子作用机制*

陈广芳，文昌晖

1 贵州中医药大学第一临床医学院，贵州 贵阳 550002；2 贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550002

银屑病是一种慢性炎症性和自身免疫性疾病，典型病理学特征为大量中性粒细胞浸润于表皮［1］，中性粒细胞外诱捕网参与心血管、肾脏损伤等血管内皮损伤过程［2］，增加心血管事件风险，抑制中性粒细胞活化可减轻银屑病皮损。银屑病尚无根治方案，目前银屑病的中医药治疗确有疗效，相比多数治疗方案，可减轻患者经济负担。

前期参照孙逊等［3］的中药复方网络药理学研究思路及过程，分别分析4 位名家验方干预银屑病的主要有效成分，包括赵炳南先生凉血活血汤［4］、国医大师禤国维教授皮肤解毒汤［5］、李斌教授益气活血方［6］、贾敏教授消疕汤［7］，通过对比分析发现其干预银屑病的有效成分均含有槲皮素。

目前无银屑病外周血中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）病理机制以及槲皮素干预银屑病外周血NE 作用机制文献报道，本研究通过GEO 芯片分析及分子对接原理分析银屑病外周血NE 的病理机制，并探究槲皮素干预银屑病外周血NE的作用机制。

1 数据库与方法

1.1 数据库本研究主要运用的数据库和平台包括GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GO数据库（gene ontology，http：//geneontology.org/）、KEGG数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/）、中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca/）、DGIdb 数据库（http：//www.dgidb.org/）、MY CANCER GENOME数据库（https：//www.mycancergenome.org/）、SwissTargetPrediction 数 据 库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、String平台（https：//string-db.org/）及RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）等。

1.2 疾病GEO芯片热图绘制通过GEO数据库收集GSE106087芯片与平台数据信息，通过R软件及edgeR、pheatmap等插件，设定P＜0.05，FDR＜1，将差异基因导入Excel表格，绘制热图。

1.3 疾病差异性基因基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG 富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）运用R 软件及enrichplot、ggplot2、DOSE、cluster Profiler、colorspace、stringi等插件，上传银屑病NE差异性基因至GO和KEGG数据库，按照P＜0.01和q＜0.05 标准筛选，将槲皮素干预银屑病外周血NE的靶点基因富集分析结果分别导入Excel表格，绘制气泡图及圈图。

1.4 化合物靶标基因收集通过TCMSP、Drug-Bank［8］、DGIdb 和MY CANCER GENOME 数据库收集槲皮素预测靶点基因，与Excel 表格取交集基因，汇总到txt文件中。

1.5 槲皮素干预银屑病外周血NE 的拓扑网络构建及验证将槲皮素与银屑病外周血NE的差异基因取交集后导入Cytoscape 3.7.2中，依次运用Bisogenet和CytoNCA 插件，设置计算中心度（DC）＞61，构建蛋白互助拓扑网络，收集核心基因。运用String平台验证槲皮素干预银屑病外周血NE差异性基因，构建蛋白-蛋白相互作用网络(proteinprotein interactions，PPI)，剔除PPI 网络中游离蛋白，收集核心差异性蛋白及基因。

1.6 分子对接证据支持收集Pubchem 数据库中槲皮素结构，通过RCSB PDB数据库下载槲皮素干预银屑病外周血NE 核心差异性蛋白结构，运用PyMOL软件去除水分子、小分子配体，并运用AutoDock软件加氢等处理后，运用Vina 进行分子对接模拟并获取对接能量，通过PyMOL 获得受体与配体分子对接可视化图。

2 结果

2.1 银屑病外周血NE 的GEO 芯片热图从GEO数据库下载GSE106087芯片与平台数据，共6个样本，获得下调基因36个，上调基因153个。展示上调基因和下调基因各30 个，颜色深度代表基因表达程度，颜色越红，基因表达越显著；颜色越绿，基因表达越不显著。Con 代表健康人NE 样本基因、Treat代表银屑病患者样本基因。见图1。

图1 正常人与银屑病患者外周血NE差异基因热图

2.2 银屑病外周血NE差异性基因GO富集分析银屑病外周血NE 差异性基因GO 富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC），按照P＜0.01 和P.adjust＜0.05筛选，共461种生物功能，其中432条BP、23条CC、6 条MF，均展示前10 条。综合P 值及富集程度，绘制圈图，fold change＞0 为上调，反之为下调。主要与生物过程中性粒细胞活化、对细菌来源分子反应等上调，以及与生物过程嗜中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞激活参与免疫反应、中性粒细胞介导的免疫等下调密切相关。见图2—3。

图2 银屑病患者外周血NE的GO富集分析气泡图

图3 银屑病患者外周血NE的GO富集分析圈图

2.3 银屑病外周血NE 差异性基因KEGG 富集分析按照P＜0.01和P.adjust＜0.05筛选，共12条信号通路。综合P值及富集程度，绘制气泡图和圈图，fold change＞0 为上调，反之为下调，结果显示银屑病外周血NE 的病理机制主要与ECHDC3、ARG1、OLFM4、CLEC12A 基因及中性粒细胞活化、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用等信号通路等上调，以及XIST、BTNL3、CCR3、SPP1 基因和中性粒细胞脱颗粒生物过程、NOD 样受体信号通路等下调关系密切。见图4—5。

图4 银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析气泡图

图5 银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈图

2.4 槲皮素干预银屑病外周血NE 基因的拓扑网络将槲皮素与银屑病外周血NE 的差异基因取交集后，共收集11个差异性基因于txt文件中，导入Cytoscape 3.7.2 软 件，使 用Bisogenet 和Cyto NCA，设置计算中心度（DC）＞61，构建蛋白互助拓扑网络。拓扑网络共得到JUN、SSP1 等28 个候选基因，其中JUN 处于最核心位置。将txt 与Excel 进行交集分析，获得槲皮素下调银屑病外周血NE 基因为MAOA、FLT3、MPO、CYP1B1、CDK5R1、ARG1、NQO2，上调银屑病NE 基因为CCL2、IL1B、JUN、SPP1。此外，将JUN、SPP1等11个差异性基因上传至String平台，进行PPI分析，可见下调银屑病外周血NE 基因FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1 以及上调银屑病外周血NE 基因CCL2、IL1B、JUN、SPP1 处于核心位置。综上可知JUN、SPP1 靶标处于核心地位。见图6—7。

图6 槲皮素干预银屑病外周血NE的基因拓扑网络图

图7 蛋白质-蛋白质相互作用信息

2.5 槲皮素干预银屑病外周血NE靶点基因GO富集分析使用R 软件，根据槲皮素干预银屑病外周血NE靶点基因，进行GO富集分析，并分别以BP、CC和MF归类收集，以P＜0.01和q＜0.05标准筛选，共收集291条BP、7条CC、14条MF。根据基因富集数目与显著程度，绘制气泡图和圈图，fold change＞0为上调，反之为下调，可知，槲皮素干预银屑病外周血NE 主要与ERK1 和ERK2 级联调控、对脂多糖的反应、JAK-STAT 信号通路的脂多糖和受体等上调，以及ERK1 和ERK2 级联反应、对细菌来源分子的反应等下调密切相关。见图8—9。

图8 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的GO富集分析气泡图

图9 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的GO富集分析圈图

2.6 槲皮素干预银屑病外周血NE靶点基因KEGG富集分析取P＜0.02 和P＜0.05，共筛选出34条（展示前20 条），主要涉及：可卡因成瘾、类风湿性关节炎、IL-17信号通路、糖尿病并发症的AGERAGE 信号通路、美洲锥虫病、Toll 样受体信号通路、TNF 信号通路、耶尔森菌感染、液体剪切应力和动脉粥样硬化、色氨酸代谢、NOD 样受体信号通路。综合P值及富集程度，绘制气泡图，fold change＞0 为上调，反之为下调。结果显示槲皮素干预银屑病外周血NE 主要与类风湿性关节炎、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、NOD 样受体信号通路等上调，以及可卡因成瘾、IL-17 信号通路、TNF 信号通路等下调密切相关，logFC＞0 为上调信息，反之为下调信息。见图10—13。

图10 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析气泡图

图11 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈图

图12 白细胞介素17信号通路

图13 肿瘤坏死因子信号通路

2.7 分子对接证据支持通过RCSB PDB 数据库，分别收集槲皮素可下调的FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1 以及上调CCL2、IL1B、JUN、SPP1 蛋白（受体）结构信息，运用PyMOL、AutoDock、Vina 等软件处理受体与配体（槲皮素）结构信息并进行分子对接模拟，分别收集分子对接模拟的最佳对接能量，绘制可视化图，以能量最低的结构为最佳结构，能量小于0 说明配体和受体可自主结合，绘制槲皮素与JUN、SPP1 等6 种受体的分子对接可视化图，而槲皮素与FLT3、CDK5R1 蛋白无法进行分子对接。图中红色箭头处为槲皮素与蛋白分子对接最佳结构。见图14、表1。

表1 槲皮素及其相关蛋白分子对接模拟能量

以上结果表明，槲皮素干预银屑病外周血NE机制主要与下调MPO、ARG1 和上调CCL2、IL1B、JUN、SPP1 及其影响的病理过程密切相关，进而下调IL-17 信号通路、TNF 信号通路，以及上调类风湿性关节炎、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、NOD 样受体信号通路等，其中与下调IL-17 信号通路、TNF信号通路关系最大。

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性和自身免疫性疾病，目前病理机制尚不清楚，文献认为IL-23/Th17 轴深度参与了银屑病的发病机制，调节IL-23/Th17轴可以减轻银屑病皮损［1］。中性粒细胞是含量最多的固有免疫细胞，其致病机制主要与慢性炎症性、自身免疫性疾病相关［9］，中性粒细胞浸润与银屑病的初始和维持阶段有关［1］。IL-23/Th17 轴由中性粒细胞浸润和角质形成细胞相互作用产生［10］，中性粒细胞可诱导肥大细胞、γδT 细胞、胞浆细胞、受损皮肤和滑膜液中的固有淋巴样细胞分泌IL-17A［11］，IL-17A 上调角质形成细胞表达CCL20 水平，CCL20 可与趋化因子受体CCR6 结合；浸润的中性粒细胞的外泌体诱导角质形成细胞表达HSP70，TLR4与其受体HSP70结合后产生IL-23，IL-23 促进Th17 细胞的活化并分泌IL-17A、IL-17F 和IL-22，IL-17A 和IL-22 诱导角质形成细胞增殖［12］；活化的角质形成细胞可释放外泌体，负反馈促进中性粒细胞活化［13］；同时，在CCR6 影响下，天然Th17 细胞被招募到银屑病表皮，并在IL-23和IL-1β辅助下浸润于表皮下，创建IL-23/Th17轴框架，加重银屑病皮损。在关节中，IL-17A 可作用于成纤维细胞、破骨细胞、软骨细胞和成骨细胞等，上调抗菌肽、趋化因子、促炎和增殖细胞因子水平，促进组织炎症和骨重塑，引发银屑病关节炎［11］。SHAO 等［14］认为，中性粒细胞外泌体诱导角质形成细胞中炎症基因表达，通过上调NF-κB 和MAPK 信号通路，上调IL-1β、IL-36G、IL-18、TNF-α和趋化因子（C-X-C基序）配体等表达水平，并募集于皮肤中，且活化的IL-36可抑制弹性酶、组织蛋白酶G和丝氨酸蛋白酶抑制剂A1 和A3［15］，最终引发脓皮病型银屑病。另外，活化的NF-κB 信号诱导角质细胞角蛋白6 和16 表达，减少细胞代谢周期［12］，进而促进角化不全。IL-17A和IL-22可上调TNF-α 表达，银屑病皮损中过表达抗菌肽LL-37，均可激活树突状细胞，加速中性粒细胞等炎性细胞从外周血向皮肤浸润［12］。因此，有效干预银屑病中性粒细胞活化及浸润可减轻银屑病皮损，中性粒细胞成为干预银屑病的有效靶点之一。

槲皮素是一种黄酮类物质，广泛存在于中药材及食物中，具有抗炎、抗氧化、保护血管及免疫调节等多种生物特性，可被用于干预中性粒细胞介导的炎症性疾病［16］。槲皮素通过下调Th17 细胞活性［17-18］，进而下调IL-1β、IL-6、IL-17、IL-36G、TNF-α和趋化因子配体等表达，抑制中性粒细胞从外周血浸润于皮肤；同时，下调IL-17A、IL-17F和IL-22 表达，抑制角质形成细胞增殖，从而减轻银屑病皮损。槲皮素减少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对角化细胞的刺激，进而释放趋化因子［19］。槲皮素通过炎症相关信号通路抑制中性粒细胞活性［20］，同时，抑制中性粒细胞自噬及NETs 形成，并抑制中性粒细胞浸润，降低外周血炎症细胞因子水平，最终促进活化的中性粒细胞凋亡［21］。此外，ZHU 等［22］研究发现槲皮素抑制UVB照射诱导毒性引起角质形成细胞释放ROS 短暂性升高，并促进细胞膜流动性和抑制线粒体膜去极化，进而减轻ROS对细胞膜和线粒体的损害。

综上所述，槲皮素干预银屑病外周血NE 主要与6 个核心靶点基因有关，分别是下调MPO、ARG1和上调CCL2、IL1B、JUN、SPP1靶标基因，而JUN、SSP1处于核心地位，说明槲皮素主要通过下调IL-17信号通路、TNF信号通路，以及调节银屑病1L-23/Th17轴，达到干预银屑病外周血NE 水平，抑制中性粒细胞在银屑病皮损区的浸润，减轻银屑病皮损。此外，槲皮素可减轻UVB 对皮肤照射的损伤，因此，将含槲皮素的中药作为干预银屑病的单体或一种防晒剂值得进一步研究。