快速免疫荧光染色技术在肺部感染性疾病中的应用

景竹春 陈宁 罗焕超

【摘要】  目的    探讨快速免疫荧光染色技术在肺部炎症性病变病原体鉴别诊断中的应用价值。方法    对明确病原微生物类型的30例肺部感染性疾病患者的临床病理资料进行回顾性分析，并结合文献复习。结果    30份支气管肺泡灌洗液标本中，放线菌5例，肺炎链球菌2例，念珠菌8例，曲霉菌4例，毛霉菌8例，隐球菌1例，抗酸分枝杆菌2例。镜下形态：放线菌呈放射状，硫磺颗粒样；肺炎链球菌，呈双球菌，矛头状，可表现为单个或短链状；念珠菌为有隔且分枝不规则的假菌丝，厚膜孢子是其特征；曲霉菌丝呈有隔且有45°分枝状，分生孢子头是其特征；毛霉菌菌丝呈无隔或少隔且有90°分枝状，球形孢子囊是其特征；抗酸分枝杆菌，特征是抗酸性，细菌形态呈金黄色，细长，略弯曲状。结论    快速免疫荧光染色检测技术能快速准确区分病原微生物种类，在肺部炎性疾病的精准治疗及早期治疗中均有一定的应用价值。

【关键词】  肺部炎症性疾病；快速免疫荧光染色；真菌；菌丝

中图分类号：R446.51        文献标识码：A

文章编号：1672-1721（2023）11-0101-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.11.034

肺部感染性疾病主要病原微生物有细菌、病毒或真菌，对慢性感染的炎性疾病，特别是缺乏特异的临床表现而且在影像学上表现为肿块的肺部疾病，明确病因，及时治疗，对改善预后尤为重要。本文探讨了免疫荧光染色检测技术在明确肺部感染性疾病病原微生物中的应用价值。

1    材料与方法

1.1    材料    2021年9月—2022年5月期间就诊于北京市第一中西医结合医院呼吸内科的肺部感染性疾病患者30例，临床表现为非急性感染，影像学上显示肺部肿块，留取支气管肺泡灌洗液并送检，病理诊断报告中明确给出微生物分类。

1.2    仪器与试剂    Nikon 80i普通显微镜、荧光模块、免疫显色试剂Ⅰ型、组织细胞荧光染色试剂和拭子均购于江苏诺鬲生物科技有限公司，载玻片和盖玻片购于广鑫生物工程公司。

1.3    方法

1.3.1    制片    将新鲜的支气管肺泡灌洗液标本使用离心机3 000 r/ min离心5 min后，取出倒掉上清液，用棉拭子蘸取试管底部富集物沉渣的细胞，在载玻片下1/3处涂抹，采用旋转推动形成同心圆状的细胞层，将制好的玻璃片置于烤片机上烤2 min。一共制3张玻璃片备用。

1.3.2    染色    细菌染色方法：取1张载玻片，采用滴染的方法，滴加1滴紫红色的免疫显色试剂Ⅰ型试剂于玻璃片的细胞层上，轻微晃动，保证试剂与样品充分混合，染色持续30 s，用盖玻片封片。

组织细胞染色方法：取第2张玻片，选组织细胞荧光染色试剂A液，滴加1滴，晃动使染色液淹没整个样本，持续30 s后倾倒，然后选组织细胞荧光染色试剂B液，滴加1滴，染色30 s后倾倒，用盖玻片封片。

抗酸分枝杆菌染色方法：取第3张载玻片，选抗酸分枝杆菌荧光染液A液，滴加一滴，染色15 min后倾倒，用滴管冲洗，然后选用抗酸分枝杆菌荧光染液B液（脱色液），滴加一滴，1 min后用纯水清洗，盖玻片封片。

1.3.3    镜下观察    B波段用于观察细菌，细菌呈桔黄色。U/V波段用于观察真菌和抗酸分枝杆菌，真菌的菌丝和孢子呈略透亮的淡蓝色，抗酸分枝杆菌呈桔黄色或金黄色。

2    结果

2.1    微生物分类    30份支气管肺泡灌洗液标本中，放线菌5例，肺炎链球菌2例，念珠菌8例，曲霉菌4例，毛霉菌8例，新型隐球菌1例，抗酸分枝杆菌2例。

2.2    荧光显微镜下形态学结果    放线菌：呈分枝状的无隔菌丝，排列形成放射状，菌丝末端膨大，硫磺颗粒样；肺炎链球菌：双球菌，矛头状，菌体宽端相对，尖端向外，多成双排列，也可单个或短链状；念珠菌：菌体呈圆形或椭圆形，藕节状有横隔的假菌丝，菌丝较细，分枝不规则，菌丝中间或顶端可见厚膜孢子，厚膜孢子是其特征（见封三图1、图2）；曲霉菌：菌体呈圆形，有隔菌丝，菌丝可分枝，呈45°或呈钝角，可见其特征性的菊花样的分生孢子头（见封三图3、图4）；毛霉菌：是一种结合菌，菌体呈圆形，多为无隔菌丝，菌丝比曲霉菌和念珠菌粗大，可见分枝，呈90°或钝角，较粗的菌丝梗上可见球形孢子囊（见封三图5、图6）；抗酸分枝杆菌：菌体呈金黄色、细长、略弯曲、单个、分枝状（见封三图7）；隐球菌：菌体为圆形或椭圆形，外周有一层肥厚的荚膜，镜下似空晕，厚度是菌体的1～3倍（见封三图8）。

3    讨论

快速现场细胞学评估（rapid on site evolution，ROSE）技术是运用细胞学的快速诊断特点，将现场所取得的标本制片后镜下观察，形成诊断意见。近几年来，由于各种微创技术，如支气管镜技术、经支气管镜超声技术、电磁导航支气管镜技术等的飞速发展，快速现场细胞学评估技术又重新回归到临床，成为介入呼吸病学的主要技术之一。ROSE技术主要包括两大部分：快速现场细胞学评价（C-ROSE），快速现场微生物学评价（M-ROSE）。目前，C-ROSE技术应用比较广泛，主要临床应用是指导肺部疾病的诊断，评估肺部疾病的治疗效果，判断介入呼吸道疾病的治疗效果，指导中央型肺癌患者治疗后的随访。快速现场微生物学评价（M-ROSE）也有相当重要的意义，如提供病原微生物的形态学意见，同一部位可多次重复取样并送检，还可对疗效进行评估[1]。有研究表明，现场细胞学评估在肺穿剌活检中能指导医生取材，提高活检成功率[2]；在CT引导下肺穿刺结合现场细胞学评估技术，诊断准确率达89.66%[3]；现场细胞学评估联合超声支气管镜技术，对肿大淋巴结或病灶穿剌获取的针吸细胞学标本评估，发现细胞学可疑查见恶性肿瘤细胞的阳性率为78.8%，作为金标准的组织学活检确诊恶性肿瘤阳性率为66.7%，二者相比无统计学差异。二者联合能减少穿刺数量，降低穿剌引起并发症的发生率，缩短操作时间。细胞学标本制片后，根据需要有以下快速染色方法：改良瑞氏染色、改良乳酸染色、改良的快速巴氏染色、甲苯胺蓝染色、支原體DNA霍氏荧光染色、金-罗耐酸菌荧光染色、试剂盒化快速革兰染色等。现场细胞学的染色方法之一快速荧光染色法，主要用于真菌的检查，能快速检测人体样本中的真菌细胞壁多糖，临床上用于浅部真菌和深部真菌感染的诊断。由于M-ROSE技术良好的特异性和敏感性，需求范围在不断增加，如皮肤真菌疾病、耳鼻咽喉炎性疾病、肺部感染性疾病等，均需要明确微生物种类，比如，要区分细菌或真菌或抗酸分枝杆菌，明确病原体类型，才能选择最佳的治疗方案。在弥散性外耳道炎和中耳炎的病原学诊断中应用广泛，外耳道感染中最多见的是曲霉菌，其次是毛霉菌和念珠菌，荧光显微镜下见典型的具有鉴别诊断意义的孢子，如曲霉菌的分生孢子头，毛霉菌的球孢子囊，念珠菌的厚膜孢子等可对微生物进行分类。在抗酸分枝杆菌检测方面，有学者研究发现免疫荧光染色法有较好的应用，杨江华等[4]研究发现，29例痰涂片抗酸染色结果为阴性者，重复制片用快速免疫荧光法染色后再次镜检，发现有15例为抗酸分枝杆菌阳性，表明免疫荧光染色法在结核分枝杆菌中能提高痰液中阴性肺结核的诊断率。刘银萍等[5]研究结果显示，在痰液标本抗酸分枝杆菌检测中，快速免疫荧光染色法的检出率为25.7%，而萋-尼染色法为13.8%，两者比较差异显著（P<0.05）。表明快速免疫荧光染色法能提高抗酸分支杆菌的阳性检出率。现场微生物学评估不仅在呼吸病学中有良好的应用价值，在甲状腺疾病、尿路恶性肿瘤诊断、阴道分泌物病原体检测及胃黏膜活检中也得到了重视。尹小毛等对39例阴道炎性疾病的病原体检测研究中发现[6]，用湿片法和免疫荧光染色法对比，前者检出线索细胞（加德纳菌感染）15例，后者检出9例，差异无统计学意义（P>0.05）；两种方法在念珠菌检测中的检出率分别为38.46%和35.9%，差异无统计学意义（P>0.05）。说明在阴道炎的病原微生物加德纳菌和念珠菌的检查中，可以应用快速免疫荧光法。

目前，肺部疾病通常是经影像学检查发现，肿瘤及肺炎占60.0%[7]。肿瘤及肺炎性病变的影像学表现相似，明确性质对治疗方案选择很重要。肺部疾病的细胞学诊断在整体细胞学诊断中占有重要的地位，根据获取标本的方法不同，主要分两类。一类为脱落细胞学标本，包括痰液、胸水、心包积液、支气管镜刷检、支气管灌洗和支气管肺泡灌洗液，另一类为细针穿刺标本。细胞病理学检查，不仅能明确疾病是肿瘤还是炎症，在炎症性疾病的诊断中也有重要作用，尤其是鉴别化脓性感染如肺炎链球菌和特异性感染疾病如结核及常见真菌感染等。病原微生物主要分非细胞型微生物，如病毒；原核细胞型微生物，如细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌；真核细胞型微生物，如真菌。细菌是原核生物界的一种单细胞微生物，按外形分球菌、杆菌、螺形菌，球菌分为葡萄球菌、链球菌、肠球菌、奈瑟菌属。分枝杆菌属分为结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、非结核分枝杆菌，分枝杆菌属的共同特点是细胞壁中含有大量脂质，细菌难以被一般染料染色，需用助染剂并加温使之着色，着色后又不宜以含有3%盐酸的乙醇脱色，故也称抗酸杆菌。真菌按形态结构分为单细胞真菌和多细胞真菌。单细胞真菌，圆形或卵圆形，如酵母型和类酵母型真菌，酵母型真菌不产生菌丝，由母细胞以芽生方式繁殖；类酵母型真菌母细胞以芽生方式繁殖出芽，产生的芽生孢子持续延长，但不断裂不与母细胞脱离，产生相互连接成藕节状较长的细胞链，称假菌丝[8]。多细胞真菌包括曲霉菌、毛霉菌、新型隐球菌等。病原微生物感染后要用抗生素治疗，不同种类的微生物有不同的敏感药物。链球菌引起的炎症可选用青霉素G，新型隐球菌感染可以两性霉素B与氟胞嘧啶联合用药，念珠菌的全身用药主要是两性霉素B、酮康唑、米卡芬净，曲霉菌病治疗主要是两性霉素B与曲康唑[9]，因此明确病原微生物种类可以指导临床用药。

荧光素标记抗体直接与病原体结合后显色，具备免疫学和形态学的双重优点，荧光显微镜下形态观察，可区分细菌与真菌。本研究中发现的细菌有放线菌，放线菌正常寄居在人和动物的口腔、上呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道，对人类致病性较强的是衣氏放线菌，可引起内源性感染。肺部放线菌多发生于农村，常见于免疫功能低下者。放线菌呈丝状，常形成无隔菌丝，需要与真菌鉴别。另外，由于放线菌具有弱抗酸性，需与抗酸分枝杆菌鉴别。实际工作中，延长盐酸酒精脱色时间，使放线菌变为抗酸阴性。抗酸分枝杆菌在本研究中也发现2例，荧光染色后显金黄色。需要注意的是，结核分枝杆菌易通过飞沫传播，标本制片过程中需要灭活。有两种方法：（1）结核分枝杆菌在75%乙醇内数分钟即死亡，因此可在制片后放入5 min来灭菌，（2）结核分枝杆菌对热敏感，可通过加热方法灭菌。肺细菌感染中肺炎鏈球菌常见，其寄居于正常人的鼻咽腔中，多数不致病，仅少数有致病力。肺炎链球菌与A群链球菌形态上都是球菌，两者的鉴别点主要是：A群链球菌由球形或椭圆形的菌体连接而成，表现为长短不一的链状；肺炎链球菌的菌体呈矛头状，宽端相对，尖端向外，多数表现为双球菌，成双排列，但在肺组织病变中可呈短链状。近年来，随着大剂量肾上腺皮质激素、细胞毒性免疫抑制剂、导管插管、器官移植化疗以及介入治疗等新诊疗技术的广泛应用，加上长期大量滥用广谱抗生素、严重的基础疾病、艾滋病、糖尿病、肿瘤等易感人群的增多，念珠菌病发病率呈明显上升趋势。念珠菌至少有20余种可致人类疾病，广泛存在于自然界的土壤、医院环境、各种物品表面及水果中。同时，在人体皮肤、口腔、胃肠道和阴道等处也能分离出来。念珠菌病的临床表现无特异性，较难与细菌感染相鉴别，可发生局部感染及深部感染，局部以皮肤、黏膜感染为主，如口腔念珠菌病、念珠菌性唇炎、念珠菌性口角、念珠菌性阴道炎、念珠菌性包皮炎；深部感染如呼吸系统念珠菌病、消化系统念珠菌病、食管和肠道感染、泌尿系念珠菌病、念珠菌菌血症、念珠菌性心内膜炎、念珠菌性脑膜炎等，一旦发生这些深部的侵袭性念珠菌病，病死率很高，一般成人15%～25%，最高达47%，新生儿及儿童略低，大约10%～15%。念珠菌为单细胞类酵母型真菌，菌体呈圆形或卵圆形，直径4～6μm，芽生方式繁殖，细菌体能发育伸长成细丝状的假菌丝，有横隔，不规则的分枝，可见芽生孢子和厚膜孢子，厚膜孢子是其特征之一。本文研究中发现曲霉菌引起的肺炎4例。最常见的曲霉菌是烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉，曲霉属于丝状真菌，是条件性致病真菌，通过气道吸入大量孢子后，如机体不能及时清除，则会导致曲霉病，主要表现为侵袭性感染和变态反应综合征。发病原理是孢子在宿主体内发育为菌丝后，细菌体的致病因子成分得以暴露，巨噬细胞可识别这些成分并分泌炎症介质，引发炎症。曲霉菌可引起过敏、肺部感染、皮肤感染和肺外传播，最常累及的部位是支气管和肺脏，还可侵犯鼻窦和皮肤。消化系统也可受累，以肝脏受累最为多见，其次是小肠、胃、食管、舌。曲霉菌为多细胞真菌，芽管方式繁殖，菌丝有横隔，分枝呈45°或钝角，分生孢子梗的顶端或侧面可形成分生孢子，呈菊花状。毛霉菌病起始病灶常位于鼻腔，很快扩散到鼻窦和中枢神经系统，再扩散到肺和胃肠道。毛霉菌属结合菌门，结合孢子，菌丝宽大，无横隔或少横隔，分枝呈90°或钝角，菌丝末端形成一种囊状结构叫球孢子囊，倒置的烧瓶状。在肺泡灌洗液标本中发现1例新型隐球菌感染引起的肺炎。新型隐球菌是隐球菌属中唯一致病的真菌，人体通常是通过吸入环境中气溶胶化的新型隐球菌孢子而感染，病原体主要存在于鸽粪、水果和土壤中，但在健康人的皮肤、黏膜和粪便中也可分离出。新型隐球菌引起的深部真菌病可累及脑膜、肺、皮肤、骨骼和血液等器官和部位，隐球菌性脑膜炎为最常见的临床类型。新型隐球菌的形态呈圆形或卵圆形，直径为5～10 μm，外周围绕着一层宽厚的多层荚膜，为主要的毒力因子。新型隐球菌可用免疫荧光染色方法查找，也可用墨汁涂片直接镜检，发现出芽的酵母样菌，外周有透亮的厚壁荚膜。还有一种方法是用黏蛋白胭脂红染色，酵母样菌的荚膜呈深玫瑰红色。本文采用免疫荧光染色法查见的新型隐球菌体为圆形或椭圆形，外周有一层肥厚的荚膜，镜下似空晕，厚度是菌体的1～3倍，比较典型。本研究发现肺部感染性疾病中真菌主要类型是念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、新型隐球菌，没有发现其他真菌如肺球孢子菌、组织胞浆菌、马尔尼菲青霉菌和耶氏肺孢子菌等引起的肺炎；可能是这些真菌性肺炎多发生于免疫缺陷患者或者南方或野外工作者，该院就诊的患者上述人群罕见，所以没有发现这些类型的真菌。

真菌和细菌的检查方法有多种，如痰培养，直接镜检，活检组织切片查找。细菌培养可以出现假阳性或者假阴性，通常培养阳性率只有10%～30%。染色方法也有多种，如HE、PAS法、六胺银染色法和快速免疫荧光染色法[10]。真菌用HE方法时，染色着色不佳；PAS和六胺银特染可用来显示念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌、毛霉菌和放线菌等，效果较佳，但是网状纤维和纤维素也被着色，在诊断中易与真菌混淆。丁如[11]的研究指出，真菌快速荧光染色法的优点是快速性、专一性、实用性、高灵敏性。肺孢子菌肺炎是耶氏肺孢子菌引起的一种机会性感染，多发生在免疫功能缺陷综合征的人群。有研究者发现[12]，流式细胞术可用于耶氏肺孢子菌检测，敏感性和特异性可达100%。流式细胞术是近年来发展的新技术，但是不足之处是价格高，耗时长，操作复杂，技术含量高，临床推广困难。在病原微生物诊断中，可联合应用快速免疫荧光法结合PCR、流式细胞术、基因序列分析等几种高新技术。

快速免疫荧光染色技术利用荧光素特异性标记细菌多糖抗原，形成强的荧光复合物，在荧光显微镜下观察荧光形态，快速有效鉴别病变性质是肿瘤还是病原微生物感染，并且根据形态能进一步明确细菌和真菌的具体类型。本研究证明快速免疫荧光染色方法能良好地显示细菌和真菌的形态，有较高的临床应用价值。目前存在的问题是，病理学者对微生物学欠重视，细胞学专家更愿意致力于细胞学评估，在微生物评估中投入精力不足，对微生物学的基本知识了解不够，判断分析微生物形态缺少严密的逻辑能力。因此，在现实工作中，要提升细菌、真菌等病原菌形态学认识水平，同时结合临床症状、影像学资料、流行病学史等，综合分析作出正确的判断。总之，相较其他检测方法，快速免疫荧光法制片简单，30 min内可出结果，镜下形态特点易掌握，而且有极高的灵敏度和特异性，无假阳性，值得在基层医院推广应用。

参考文献

[1]    王承志，王咏梅，杨庆婵.快速现场细胞学评估在肺穿刺活检中的应用[J].天津医药，2021，49（1）：94-97.

[2]    李燕燕，李凯述，王洵，等.快速现场细胞学在CT引导下经皮肺穿刺活检肺外周结节中的应用[J].中国介入影像与治疗学，2020，17（1）：18-21.

[3]    庚俐莉，刘春芳，马海英，等.现场细胞学在超声支气管镜引导下支气管针吸活检的应用价值[J].中国肿瘤临床与康复，2017，24（3）：292-294.

[4]    杨江华，朱晓玥，王文节.免疫荧光染色法检测结核分枝杆菌的建立与临床應用[J].中国实验诊断学，2015，19（5）：775-777.

[5]    刘银萍，吕尚军，贺雄，等.两种染色法在分枝杆菌检测中的临床应用价值[J].解放军医学杂志，2012，37（6）：669-673.

[6]    尹小毛，赖少芬，冯洁仪，等.免疫荧光在阴道分泌物病原体检测中的应用[J].检验医学与临床，2012，18（15）：2220-2222.

[7]    张国桢.实用胸部CT诊断学[M].北京：科学技术文献出版社，1994：100-102.

[8]    李凡，徐志凯.医学微生物学[M].北京：人民卫生出版社，2021：93-94.

[9]    李兰娟，任红.传染病学[M]. 北京：人民卫生出版社，2013：239-247.

[10]    王德田，董建强.实用现代病理学技术[M].北京：中国协和医科大学出版社，2012：134-137.

[11]    丁如.临床检验中免疫荧光技术的应用[J].实用医技杂志，2013，20（12）：1325-1326．

[12]   BARBOSA J，BRAGADA C，COSTA DE OLIVEIRA S，et al．A new method for the detection of Pneumocystis jirovecii using flow cytometry[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2010，29（9）：1147-1152．

（收稿日期：2023-01-26）