野生菌中鹅膏毒肽和鬼笔毒肽检验方法及样品处理技术研究进展

谭建林，曾明梅，赵秀琳，赵小林，彭珍华，张雪媛，陈明瑶，王吉祥，牛之瑞，马雪涛

（云南省产品质量监督检验研究院，国家热带农副产品质量检验检测中心，昆明 650223）

我国野生菌资源丰富，相关研究共鉴定出1020种可食用、692 种药用和480 种有毒野生菌[1]。许多有毒野生菌与可食用物种的外观形态特征相似，人们不易对其进行区分，因误食有毒野生菌而导致中毒的事件时有发生[2‒6]。野生菌中毒是我国食源性疾病的主要原因，2019～2020 年，我国有记载的野生菌中毒总体病死率为1.89%，其中，急性肝毒性中毒的病死率为12.6%，占总死亡人数的78.7%[6‒7]。我国野生菌中毒事件表现出明显的季节性，5～10月为高发，12～次年2月为低发。2004～2009年6～9月野生菌中毒事件在当年所有野生菌中毒事件中占比达到84.88%；2010～2020 年5～10 月中毒事件在当年所有中毒事件中占比达到94.1%。除西藏自治区外，中国其它31 个省/直辖市/自治区均有野生菌中毒事件，其中云南、湖南、贵州、四川和江西5个省占野生菌中毒事件的79.7%[6,8]。

目前普通民众对于有毒野生菌的识别方法仍停留于形态学分类等粗略的识别方式。很多野生菌形态极为相似，难以分辨，利用外观形态鉴别新鲜野生菌尚有一定的可能性，但无法用于鉴别经过干燥包装成商品的野生菌。野生菌中毒事件严重危害人们的生命和健康安全，制约着野生菌产业的升级和发展。野生菌中毒具有发病快、临床表现多样等特点，而且目前治疗手段单一，疗效不理想，因此野生菌中毒后及时进行毒素检测，对中毒事者的治疗能起到关键的作用。随着通用检测技术的发展，蘑菇毒素的检测技术也在不断的推陈出新，出现了一些成本低、快速的检测方法，为防范野生菌中毒以及野生菌中毒患者的治疗提供了可靠的技术支撑。

1 鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的中毒机理

目前，约90%野生菌中毒死亡由误食鹅膏肽类毒素的鹅膏菌引起[9‒10]，引起急性肝毒性中毒的致命蘑菇毒素主要为鹅膏毒肽和鬼笔毒肽等环状多肽类毒素，其中，鹅膏毒肽是一类双环八肽，化学结构及化学信息见图1a 和表1[11]，鹅膏毒肽主要包括α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和γ-鹅膏毒肽；鬼笔毒肽为双环七肽，化学结构及化学信息见图1b和表2[11]，主要包括羧基二羟基鬼笔毒肽、羧基三羟基鬼笔毒肽和二羟基鬼笔毒肽[12‒13]。上述毒素毒性最强的是α-鹅膏毒肽，对人的半数致死量(LD50)为0.1 mg/kg[14]。该类毒肽毒耐高温、干燥和酸碱环境，一般的烹饪加工不会破坏其毒性，不幸误食后，毒肽会通过消化系统进入肝脏，对肝脏造成难以修复的损伤，最终可能引发多器官功能衰竭死亡[15]。鹅膏毒肽的作用机理是通过结合和抑制肝细胞中的真核RNA 聚合酶II 来干扰DNA 转录。抑制mRNA 合成会通过抑制蛋白质合成导致细胞坏死，从而导致肝衰竭和肾损伤。鬼笔毒肽可专一性与纤维状肌动蛋白丝结合，形成稳定的丝状肌动蛋白毒肽复合物，破坏微丝的聚合和解聚的动态平衡；也能使肝脏重量急剧增加，体积增大，几乎占体腔体积的一半，晚期肝脏较硬[16]。

表1 鹅膏毒肽类化学信息

表2 鬼笔毒肽类化学信息

图1 鹅膏毒肽类和鬼笔毒肽类蘑菇毒素化学结构

2 鹅膏毒肽和鬼笔毒肽检测样品处理技术

2.1 蛋白沉淀法

蛋白沉淀法是毒素检测分析过程中对生物样品进行前处理的一种常用净化方式，对于富含蛋白质的样品，在进行分离和提取时将大量干扰检测的蛋白质进行沉淀除去，使待测毒素仍留存于提取溶液。张秀尧等[17]比较了乙腈、甲醇和丙酮作为蛋白沉淀剂的效果，乙腈沉淀效果最好，蛋白沉淀完全，易于离心和分离，并在乙腈中加入乙酸可以提高β-鹅膏毒肽的回收率。该方法适用于尿液和血浆中3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽的确证分析。

2.2 固相萃取技术

固相萃取(SPE)技术是利用固体吸附剂将样品提取液中的目标化合物吸附，与提取液中的基体和干扰物等分离，再用洗脱液进行洗脱或加热解吸附，达到杂质分离和目标化合物富集的目的。固相萃取作为检测的前处理技术，由于其成本低、效果好等特点，在化学检测中得到了越来越广泛的应用。BJS 202008[18]采用亲水-亲油平衡(HLB)固相萃取技术对样品提取液进行净化，测定蘑菇中3 种鹅膏毒肽和3 种鬼笔毒肽，这也是目前我国检测机构普遍使用的蘑菇毒素检测方法。ZHANG S 等[19]首次使用PRiME HLB的样品处理技术，用于血液中3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽的检测分析。并比较了WAX、WCX、HLB和PRiME HLB四种固相萃取技术，HLB和PRiME HLB 都能达到令人满意的回收率，但是，对于血液样本来说，PRiME HLB 可以去除基质中90%以上的赖氨酸甘油磷酸胆碱，如果采用96位的孔板，效率和成本控制可以得到很大的提升，同时也能降低血液样本的基质效应。

2.3 在线净化技术

常规固相萃取净化法存在溶剂使用量大、使用成本高等缺陷。在线净化通过扩散溶解和尺寸排阻等技术可以将蛋白质等生物大分子去除，保留小分子化合物；利用串联质谱联用技术，可极大简化样品处理步骤，在实现在线净化的同时，可保证检测方法的准确度和灵敏度[20]。徐小民等[21]和方力[22]基于在线固相萃取的精准净化技术，研究尿液中痕量α-鹅膏毒肽检测时基质效应的消除方法，建立了尿液中痕量α-鹅膏毒肽的在线SPE-LC-MS/MS检测技术，以解决野生菌中毒患者生化指标异常前72 h (甚至96 h)内毒素鉴定难的问题，为野生菌中毒患者的早诊断、早治疗，有效降低患者死亡率提供检测技术支撑。

2.4 免疫亲和技术

免疫亲和技术(IAC)是一种利用抗原和抗体特异性可逆结合特性的SPE 技术，利用抗原抗体的高选择性，可以从复杂样品中选择并富集目标化合物。普通的固相萃取均为非特异性的净化方法，选择性和去除干扰物的效果不好，而生物样品成分非常复杂，样品中基质成分会影响检测方法的准确性。张秀尧等[23]采用鹅膏毒肽免疫亲和技术对尿液和血浆样品进行净化，该技术对α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽的平均吸附率分别为83.6%、89.6%和86.4%，且对羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽的平均吸附率均为0，说明免疫亲和柱的特异性吸附较强。该方法3种鹅膏毒肽的检出限和定量限分别为0.004、0.01 ng/mL，方法的灵敏度比其它方法有了10倍以上的提升。

3 鹅膏毒肽和鬼笔毒肽检测技术进展

3.1 快速检测法

传统的检测方法耗时久，在实际应用中会受到一定限制。快检方法作为传统检测方法的补充，在食品安全检测中可以起到基本保障的作用，在基层实验室或现场检测中发挥着重要的作用。蘑菇毒素的检测一般采用仪器法，但该类方法存在检测时间长、操作繁琐以及仪器昂贵等问题，其应用受到限制。Bever 等[24]报道了新型单克隆抗体(mAbs、AMA9G3 和AMA9C12)的产生以及竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)的开发，简化了蘑菇样品的提取程序，基于mAbs的cELISA可以简单而快速检测蘑菇样品的鹅膏毒肽。刘河冰等[25]成功合成了α-鹅膏毒肽半抗原，制备了α-鹅膏毒肽单克隆抗体，建立了一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的间接竞争酶联免疫吸附方法，该方法的50% 抑制浓度(IC50)为2.8 μg/kg，检出限为0.88 μg/kg。

3.2 毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)法

CE-MS联用技术是20世纪90年代末期发展起来的一种将毛细管电泳的高分辨率和质谱的高灵敏度相结合的技术。Rittgen等[26]开发了一种CE方法，可以对3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽进行有效分离，在正离子模式和负离子模式下，研究了它们在MSn实验中的碎裂模式和所用接口的鞘液混合物对信噪比的影响，经过优化方法和方法验证，检出限为13～79 ng/mL(17～87 nmol/L)。

3.3 高效液相色谱(HPLC)法

HPLC法广泛应用于毒素的检测分析。张秀尧等[27]用立超高效液相色谱-二极管阵列检测法分离检测蘑菇中3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽，流动相为10 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈，梯度洗脱，二极管阵列检测器波长为210～400 nm，方法准确、灵敏、选择性强。钟加菊等[28]采用反相高效液相色谱法对采自云南楚雄双柏县的致命鹅膏菌在3个不同生长期中不同部位的6种环肽毒素含量进行了检测和分析。生长期毒素总量最高(9.3 mg/g)，从成熟期(7.5 mg/g)到衰老期(6.5 mg/g)逐渐降低，但鬼笔毒肽(羧基三羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽)的相对含量随着年龄增长而逐渐增加，鹅膏毒肽(α-，β-鹅膏毒肽)与鬼笔毒肽比值从生长期、成熟期到衰老期分别为2.6 mg/g、1.4 mg/g和0.9 mg/g。

3.4 液相色谱-质谱联用(LC-MS)法

3.4.1 液相色谱-离子阱质谱(LC-IT-MS)法

离子阱质谱(IT-MS)利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器，可实现多级质谱MSn。该技术最早主要应用在代谢组学和蛋白组学的研究，也适用于鹅膏毒素的测定，如Filigenzi 等[29]采用液相色谱-多级线性离子阱质谱联用(LC-IT-MSn)法对中毒后人和动物的血清和肝脏蕈菌毒素进行定性与定量分析，以MS/MS/MS模式测定血清和肝脏中α-鹅膏毒肽的含量，方法的检出限为0.5 ng/g，首次对人和动物中毒患者血清和肝脏中α-鹅膏素进行阳性质谱鉴定并作出定量研究报告。

3.4.2 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法

液相色谱与串联质谱是一种先进的分析技术，液相色谱的分离能力能使样本中复杂的基质组分得到分离，利用三重四极杆质谱的灵敏度高和特异性强的质量分析能力能对样本中目标物进行准确的定性及定量分析。赵丽等[30]采用超高效液相色谱-质谱法测定蘑菇中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽等5种毒肽的含量，检出限为0.100～0.300 mg/kg。郎乐等[31]建立了LC-MS/MS法测定野生菌中6中鹅膏肽类毒素的含量，采用固相萃取柱净化和多反应监测模式监测，检出限达到20 μg/kg，方法灵敏度高，重复性好。周贻兵等[32]采用超高效液相色谱-串联质谱法对人血浆中6种蘑菇毒肽进行检测，6种蘑菇毒肽的线性范围均在3.12～125 μg/L，测定下限为2.0～5.0 μg/L。Abbott[33]首次采用同位素标记的15N10-α-鹅膏毒肽作为内标，开发了一种液相色谱-串联质谱法来检测尿液中的α-鹅膏毒素、β-鹅膏毒素和γ-鹅膏毒素，采用内标定量的α-鹅膏毒素测定值的相对标准偏差不大于5.49%，回收率为100%～106%。

3.4.3 液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(LC-QTOF-MS)法

柳洁等[34‒35]建立了血清和尿液中α-鹅膏毒肽，β-鹅膏毒肽，二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽毒素的超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱测定方法，以及基于超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC-ESI-Q-TOF)的4种鹅膏肽类毒素特征信息的色谱和质谱指纹图谱和分析鉴定方法。UPLC-ESI-Q-TOF 可以准确测定鹅膏肽类蘑菇毒素的分子离子及其同位素的质量数和丰度比，与二级质谱的分子结构碰撞裂解特征比较分析，在对样本中未知化合物的鉴定比常规液相色谱-串联质谱技术更为精准和可靠，而且有较好的灵敏度，两种方法目标毒肽的检出限为5～10 ng/mL。血清样品采用乙腈沉淀蛋白，野生菌样本使用OasisHLB固相柱进行净化，方法简便，准确，可靠，利用色谱技术和质谱指纹图谱能够鉴定化合物的结构特性，进行定性分析，也能使用离子对进行准确的定量，在突发事件中毒检测鉴定中能够发挥重要的作用。

4 总结与展望

目前，约90%野生菌中毒死亡由误食鹅膏肽类毒素的鹅膏菌引起，由于野生菌样本、尿液和血浆等基质复杂，越来越多的样品处理技术被应用，同时检测方法也呈多样化发展趋势。随着科学技术的进步，检测仪器和检测技术的不断革新，鹅膏毒肽蘑菇毒素的检测前处理技术不断简化，检测方法灵敏度、稳定性和精密度不断提高，检验所需时间不断缩短。目前的方法都是针对一种或者两种样本，无法覆盖所有的样本基质。此外，目前的方法存在仪器和耗材昂贵、检测时间长以及操作繁琐等问题，限制着其应用，无法实现在初级实验室、超市、农贸市场、酒店、餐馆等场所都可进行鹅膏毒肽蘑菇毒素的现场检测。因此，在关注大型仪器方法不断精准的同时，更加需要简便、准确的现场检测方法，弥补目前蘑菇毒素快速检测方法的空缺，促进我国食品监管机构对于蘑菇及其制品中鹅膏毒肽类蘑菇毒素的监管。同时，蘑菇生产企业或从业人员也能应用快速检测方法保证产品的质量安全，普通消费者亦能利用自检保障所采购的蘑菇或蘑菇制品的安全性，为消费者的生命安全保驾护航，有助于防范该类食品安全问题。