普洱茶冷凝回流茶香水挥发性物质解析及萃取条件优化

石禾云，张娅，杨豆豆，王超，张军，通信作者

（1. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300392；2. 天士力控股集团有限公司研究院，天津 300410；3. 湖南农业大学 园艺学院，长沙 410125）

为了满足速溶茶等茶饮料的香气，香气富集回收技术成为目前香气研究的一个热点，同时也是难点，尤其回收无残留、无污染、可食用的香气物质应用于食品加工领域更是不易。目前常用的香气富集方法有溶剂萃取法[1]、超临界CO2萃取法[2]、酶解法[3]、分子蒸馏法[4-5]等，这些方法大多适合于香气提取检测，不适合工厂大规模的生产加工，且有溶剂等有害物质残留，不利于食品加工领域。夏云敏[6]采用沸水冲泡红茶后95 ℃水浸提2 min 过滤冷却，再蒸馏（常压蒸馏和减压旋蒸）以完全蒸发完为终点收集茶香气水，结果显示常压蒸馏法提取挥发性物质总量和数量较多，但得到的茶香气水有焦熟味；减压旋蒸所得到的茶香气水香气与原茶汤较接近，但其茶香气水的香气较弱。

目前，有许多文献对普洱茶中香气成分进行研究，但是对于普洱茶冲泡过程中香气成分变化的研究较少。何理琴等[7]、王彩楠等[8]分别采用正山小种和武夷岩茶通过沸水浸泡，取浸泡后的茶汤进行检测分析香气成分及其释放规律。本试验采用冷凝回流的方式对普洱茶浸提过程中的香气物质进行富集，并以富集后的茶香水为研究对象，对其香气成分进行研究。顶空固相微萃取（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）技术分析普洱茶茶香水中的香气成分，以期为普洱茶香气回收技术提供分析技术和数据支撑，更为后期研究普洱茶香气热释放规律、香气物质间相互作用及基质组分对香气物质释放的影响提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

普洱熟茶（古树配方：古树熟茶混合茶样）由云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司提供；NaCl（色谱纯）、正癸醇（分析纯）购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.2 仪器设备

低温冷却循环泵 无锡沃信仪器制造有限公司；DZTW 型调温加热套 天津天泰仪器有限公司；BCD-551WPCX 型冰箱 合肥美菱股份有限公司；Trace1310 ISQLT 气相色谱-质谱联用仪、自动进样器、超纯水机 美国Thermo 公司；HP-5MS 石英毛细管色谱柱 美国Agilent 公司；75 µm CAR/PDMS 固相微萃取萃取头 美国Supelco 公司；移液枪 德国Eppendorf 公司；ME204T 型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo 公司；标准筛上虞市五星冲压筛具厂；高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.1.3 样品制备

普洱茶冷凝回流茶香水样品制备：称取普洱茶300 g，装入5 000 mL 圆底烧瓶，加入2.4 L 沸水，采用加热套给圆底烧瓶加热，圆底烧瓶上方连接转接口再连冷凝管，冷凝管连接低温冷却循环泵，低温冷却循环泵不断将0～2 ℃冷凝水循环进冷凝管中，使冷凝管一直处于低温状态，冷凝管另一端放置500 mL三角瓶接收冷凝回流茶香气水，当三角瓶中茶香气水达到500 mL 时停止接收并密封，放入4 ℃冰箱，待测。

普洱茶茶叶样品制备：普洱茶茶叶用粉碎机粉碎，过60 目筛，待测。

1.2 方法

1.2.1 GC-MS 条件

样品前处理：用移液枪吸取1 mL1.1.3 制备的茶香水样品和10 μL 正癸醇（内标物，质量浓度0.133 mg/mL），并用电子分析天平称取不同百分比的NaCl 加入20 mL 顶空瓶中，HS-SPME 程序使用Thermo 自动进样器进行，样品在孵化炉中平衡10 min 后，在不同萃取温度和不同萃取时间条件下 ，使用75 µm CAR/PDMS 萃取头在孵化炉中经过萃取后，立即进GC-MS 进样口解吸附5 min 进行分析。

普洱茶茶叶检测根据响应面试验结果进行，按茶水比1∶3，将5 mL 二纯水、1.66 g 茶叶、20 μL 正癸醇（内标物，质量浓度0.133 mg/mL）、40%NaCl（2 g）加入20 mL 顶空瓶，萃取时间60 min、萃取温度61 ℃。其他检测条件均与茶香水检测一致。试验重复3 次。

GC 条件：色谱柱HP-5MS 石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃，载气使用氦气（纯度≥99.999%），流速1.0 mL/min，升温程序参考徐咏全等[9]的研究。分流模式：分流比为30∶1。

MS 条件：电子电离（Electron ionization，EI）源；电离能量70 eV；离子源温度：250 ℃；传输线温度：250 ℃；质量扫描范围m/z 35～450，溶剂延迟时间为3 min。

1.2.2 HS-SPME 萃取条件单因素试验设计

以普洱茶冷凝回流茶香水被检出的香气化合物总峰面积为考察指标，分别研究萃取温度（30、45、60、75 ℃）、萃取时间（40、50、60、70 min）、NaCl 的添加量（0、10%、20%、30%、40%）3个因素对香气化合物萃取效果的影响，以普洱茶冷凝回流茶香水中香气化合物总峰面积为评价指标，总峰面积越大说明萃取效果越好。

1.2.3 响应面试验设计

根据单因素试验分析结果，进行Box-Behnken响应面试验设计，为增加试验结果的准确性和可靠性，以被检出率大于50%的香气化合物总峰面积为响应值。响应面试验设计因素与水平见表1。

1.3 数据处理

GC-MS 分析所得的色谱图经过NIST 谱库检索定性。取匹配度大于700 的挥发性化合物，根据大量文献报道建立普洱茶香气物质及其呈香描述自建库，将检测到的香气物质采用响应面软件Design Expert 12 和Excel 2016 进行数据分析，Origin 2021 作图。用内标半定量方法分析茶叶和茶香水中各组分的含量，计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取温度对总峰面积的影响

按照1.2.1 方法，添加30%NaCl，分别在30、45、60、75 ℃条件下萃取50 min 后，考察不同萃取温度对普洱茶冷凝回流茶香水香气物质总峰面积的影响，从而选择合适的萃取温度。试验结果如图1。

图1 萃取温度对香气物质总峰面积的影响

在HS-SPME 使用自动进样器模式进样时，萃取温度就是孵化炉的设置温度，自动进样器先将样品放入孵化炉中平衡10 min 后，样品温度上升到与孵化炉温度一致，开始萃取。图1 中，在萃取时间和NaCl 添加量固定的条件下，随着萃取温度的增加普洱茶冷凝回流茶香水香气物质总峰面积呈现先增加后减少的趋势，在30～60 ℃总峰面积快速上升，60 ℃时香气物质的平均总峰面积最大，60 ℃之后总峰面积快速下降。故本试验选择萃取温度为60 ℃进行下一步试验。

2.1.2 萃取时间对总峰面积的影响

按照1.2.1 方法，添加30%NaCl，萃取温度为60 ℃，萃取时间分别为40、50、60、70 min。考察不同萃取时间对普洱茶冷凝回流茶香水香气物质总峰面积的影响。从而选择合适的萃取时间。试验结果如图2 所示。

图2 萃取时间对香气物质总峰面积的影响

在HS-SPME 前处理试验中，萃取时间是指将一定纤维涂层的萃取头暴露于顶空瓶中样品上空并吸附样品中挥发性化合物的时间。图2 中，在萃取温度和NaCl 添加量固定的条件下，随着萃取时间的增加普洱茶冷凝回流茶香水香气物质总峰面积呈现先上升后下降的趋势，在萃取40～50 min 总峰面积快速上升，50 min 时总峰面积达到最大值。50 min 之后总峰面积快速下降，60～70 min下降速度缓慢。这一变化可能是开始时香气物质从样品中快速向萃取头表面扩散，随着萃取时间的增加萃取头表面逐渐趋于饱和，吸附不了更多物质，反而使萃取头中的物质向空气或者样品中扩散。本试验选择萃取时间为50 min 作为最佳条件进行下一步试验。

2.1.3 NaCl 添加量对总峰面积的影响

按照1.2.1 方法，加入0、10%、20%、30%和40%NaCl，添加量相应为0、0.1、0.2、0.3 和0.4 g/mL。在60 ℃条件下萃取50 min，考察不同NaCl 添加量对普洱茶冷凝回流茶香水香气物质总峰面积的影响。从而选择合适的NaCl 添加量。试验结果如图3。

图3 NaCl 添加量对香气物质总峰面积的影响

由图3 结果显示，在萃取温度和萃取时间固定的条件下，随着NaCl 添加量的增加普洱茶冷凝回流茶香水香气物质总峰面积也不断增大，NaCl添加量在30%之后总峰面积增速开始下降，可能是NaCl 趋于饱和的原因，添加40%的NaCl 时香气物质的平均总峰面积最大，萃取效果最好。

2.2 响应面试验设计及结果验证

2.2.1 响应面试验优化

根据表1 中响应面优化设计进行试验，试验结果如表2 所示。

表2 响应面试验设计与结果

响应面试验以所有检测的响应面样品中被检出率大于50%的香气化合物平均总峰面积作为响应值，进行响应面数据分析。

利用Design Expert 12 响应面软件进行多元回归分析，得到二次多项回归模型：Y＝6.410＋0.372A＋0.502B＋2.350C＋0.068AB－0.258AC＋0.379BC－0.979A2－0.327B2－0.100C2。

由表3 可知，该回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＝0.140 6），复相关系数的平方r2＝0.985 0，校正复相关系数为radj2＝0.965 8，说明该模型可以解释96.58%试验所得色谱峰面积的变化，表明回归方程拟合度良好。Y的变异系数（Coefficient of variation，CV）表示试验的精确度，CV 值越低，试验的可靠性越高，本试验中CV＝5.90%＜10%，说明试验方法可靠[10]。从表中可以看出，B、C、A2对普洱茶冷凝回流茶香水香气物质总峰面积的影响为极显著（P＜0.01），A对香气物质总峰面积的影响为显著（P＜0.05），说明萃取时间和NaCl添加量对普洱茶冷凝回流茶香水香气成分萃取影响很大，而且说明萃取温度对普洱茶冷凝回流茶香水香气成分萃取的影响以非线性变化为主[11]。响应曲面坡度弯曲程度，反映各因素的交互作用对响应值的影响敏感程度，曲面越陡峭，各因素的交互作用对于响应值的影响程度越大，反之则影响越小。

表3 响应面试验回归方程方差分析

根据图4 中曲面陡峭程度，可以得出各因素交互作用对普洱茶冷凝回流茶香水香气成分萃取效果影响程度排序为：萃取温度与萃取时间＞萃取时间与NaCl 添加量＞萃取温度与NaCl 添加量。

2.2.2 模型验证

对回归模型进行预测，得到HS-SPME 法分析普洱茶冷凝回流茶香水香气成分的最佳条件为萃取时间60 min、萃取温度61.38 ℃、NaCl 添加量40%，预测普洱茶冷凝回流茶香水香气成分总峰面积为9.223×109。调整最佳条件为萃取时间60 min、萃取温度61 ℃、NaCl 添加量40%进行模型验证。此条件下，普洱茶冷凝回流茶香水香气成分总峰面积为10.025×109，测出的试验值与预测值接近，且试验值比预测值高，说明该数学模型良好。

2.2.3 普洱茶香气成分分析

在顶空固相微萃取条件优化的基础上，采用GC-MS 对普洱茶茶香水和茶叶进行定性和定量分析，得到普洱茶茶香水和茶叶总离子流色谱图如图5 和图6 所示。

图6 普洱茶茶叶GC-MS 总离子流色谱图

根据普洱茶茶香水和茶叶挥发性物质检测结果与普洱茶香气物质及其呈香描述自建库进行对比，得到普洱茶茶香水和茶叶中的香气成分及其呈现气味如表4 所示。

由表4 可知，普洱茶冷凝回流茶香水中被检出率大于50%的香气化合物有31 种，（E，E）-2，4-庚二烯醛、1，2，3-三甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯、3，4-二甲氧基甲苯、α-松油醇、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酮、芳樟醇、（Z）-茉莉酮、香叶醇、异佛尔酮、棕榈酸乙酯等15 个香气物质被检出率为100%，改变NaCl 添加量、萃取时间、萃取温度等条件后依然能在样品中检测到，可见这些物质是普洱茶中较为重要的香气化合物，且稳定性较好。

在响应面最佳前处理条件下检测分析结果显示，普洱茶中主要含有甲氧基苯类、醇类、酮类、醛类、酯类等六大类香气成分，其中甲氧基苯类主要贡献陈香、木香的香气[18]；醇类主要呈现玫瑰等甜花香；酮类主要呈现果香、紫罗兰等花香香气。GC-MS 的检测结果显示，在普洱茶茶叶中检测出挥发性化合物92 种，其中有30 种在目前已有的茶文献中被鉴定为呈香成分，它们的总含量为7.60 mg/L，其中醛类8 种（0.51 mg/L），醇类7 种（0.90 mg/L），酮类6 种（0.34 mg/L），甲氧基苯类4 种（4.74 mg/L），酯类3 种（0.91 mg/L），其他化合物2 种（0.21 mg/L）；提取出的茶香水中挥发性化合物有144 种，呈香成分有30 种，总含量 16.30 mg/L，包括8 种醇类（2.63 mg/L）、8 种酮类（3.02 mg/L）、6 种醛类（2.10 mg/L）、4 种甲氧基苯类（7.85 mg/L）、3 种酯类（0.63 mg/L）、其他化合物1 种（0.49 mg/L）。因此，从挥发性物质数量上来看，茶香水中挥发性化合物比茶叶多52种，且茶香水中包含了茶叶中绝大部分香气成分；从香气成分含量上来看，和普洱茶叶相比，提取出的茶香水香气成分总含量增加了2.14 倍，具有普洱茶独特陈香的甲氧基苯类物质增加1.66 倍，尤其是普洱茶中陈香的主要贡献性香气物质1，2，3-三甲氧基苯；醛类增加4.12 倍；醇类增加2.92 倍；酮类增加9.01 倍；而酯类物质则减少。这种不同程度增加和下降的原因还可能与普洱茶主要水溶性基质组分和香气物质相互作用有关[19]。此外，茶香水中以花香和果香为主的酮类物质与其他物质的相对含量增率最大，一定程度上增加了其花香和果香的比例，因此，香气物质之间的相互作用，使得茶香水中甲氧基苯类物质的陈味、霉味、草药味受到抑制[20]，使提取出的茶香水除了具有陈味、草药味外，还具有更多的花香和果香等特征香气。提取出的茶香水香气物质含量的增加说明这种香气富集回收技术具有可行性，此技术不需要溶剂萃取，安全无污染且操作简单，具有一定的应用价值。

除了香气化合物含量，香气阈值也是一个值得关注的指标。气味阈值即该化合物在水中的嗅觉阈值浓度，低阈值的化合物很可能是重要赋香化合物[21]，试验中可以将化合物的含量与其气味阈值同时作为考察其对于普洱茶整体香气贡献程度的指标。某化合物的含量与其气味阈值的比值等于气味活性值（Odor activity value，OAV）[22]，OAV 经常用于评价化合物对香气的贡献程度，OAV 越大，则该化合物对香气贡献越大，某些化合物虽然在样品中的含量低，但其气味阈值也很低的情况下，OAV 值就高[23]。含量不是很高但阈值较低的化合物有：香叶醇、芳樟醇和α-紫罗兰酮，说明这几个香气化合物的香气贡献率也不低，给普洱茶增加了更多的木香、花香等特征香气。

3 结论

在单因素试验的基础上，通过响应面分析得到普洱茶冷凝回流茶香水HS-SPME 最佳萃取时间60 min、萃取温度61 ℃、NaCl 添加量40%，在此条件下，试验结果与预测值接近，且验证试验结果高于预测值，说明模型预测性和准确性良好。并从普洱茶冷凝回流茶香水中检测出31 种被检出率大于50%的香气化合物，被检出率等于100%的香气化合物有15 种。在响应面试验得到的最优条件下检测普洱茶茶叶，与茶香水相比较，发现采用冷凝回流方式收集的茶香水中挥发性化合物比茶叶原料中的挥发性化合物多52 种，茶香水中主要香气物质与普洱茶茶叶基本一致，以1，2，3-三甲氧基苯为首的甲氧基苯类物质含量均最高，为普洱茶茶香水和茶叶中主要的香气化合物。此香气回收技术提取出的茶香水香气物质含量比茶叶原料中的香气物质含量增加了2.14 倍，这种香气富集回收技术具有可行性，此技术不需要溶剂萃取，安全无污染，操作简单，具有一定的应用价值。茶香水中不同种类化合物不同程度增加或者下降的原因有可能与普洱茶基质组分和香气释放相互作用有关，香气释放规律及影响香气释放因素等还需深入研究。本文采用冷凝回流的方式进行普洱茶中香气物质的富集及茶香水中香气物质的研究，为普洱茶冲泡过程中香气热释放规律及基质组分对香气释放影响的研究提供了理论基础。