向日葵花盘蛋白提取工艺优化分析酶解物抗氧化活性研究

◎ 董毓卿，张挺嘉，马惠茹，刘红微，刘 帅

(河套学院农学系 长江大学农学院，内蒙古 巴彦淖尔 015000)

向日葵作为我国主要的油料作物，对盐碱、干旱、瘠薄土地等具有较强抗性，有较广的种植区域，其中，内蒙古、新疆、东北三省的种植面积最大[1]。向日葵种子是主要经济作物，可食用或榨油。葵花盘作为向日葵副产物，除部分作为饲料加工原料，大多数都弃之荒野或填埋处理，这样极易造成资源浪费和环境污染。

植物多肽的生物活性很多，抗氧化活性是其重要生物活性之一，也是目前研究的热点[2，3]，但多数研究集中在植物籽蛋白[4-6]，对葵花盘、秸秆等农业低值副产物研究较少。葵花盘中含有多糖、黄酮、生物碱等多种活性成分[7-9]，其中，总蛋白含量与粮食相近，约为7%～13%[10]。因此，对向日葵花盘蛋白进行开发利用，不仅能提高农业低值副产物利用率，还能减少对环境造成的污染，为向日葵花盘的综合利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自然晾晒干制的向日葵花盘，采自内蒙古巴彦淖尔市临河区远景村；中性蛋白酶、碱性蛋白酶，上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

PR124ZH电子天平，奥豪斯OHAUS仪器有限公司；EU-2200紫外可见分光光度计，杭州绿博仪器有限公司；PHSJ-3F实验室pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

将脱籽后自然晾晒干制的葵花盘，磨粉过筛（70目），正己烷脱脂后40～50 ℃条件下烘干，制得葵花盘粉，备用。

1.3.2 葵花盘蛋白质含量测定

葵花盘总蛋白含量采用GB 5009.5—2016中的第1种方法进行测定。

葵花盘粉提取液中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。蛋白质浓度标准曲线如图1所示。

图1 蛋白质标准曲线图

1.3.3 葵花盘粗蛋白提取

将上述制得的葵花盘粉，按一定的料液比调配成水溶液，调节浸提液pH及温度，浸提液于4000 r/min的速度离心20 min。去沉淀后，上清液使用0.1 mol/L HCl调节pH至等电点，4000 r/min的速度离心20 min，沉淀用蒸馏水洗至中性，真空冷冻干燥制得葵花盘粗蛋白，备用。

1.3.3.1 单因素实验

以葵花盘蛋白提取率为指标，分别考察在料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、浸提温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）、浸提时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）、碱液pH（pH9、pH10、pH11、pH12、pH13）对葵花盘蛋白提取率的影响，确定葵花盘粗蛋白提取实验的正交试验条件范围。

1.3.3.2 正交试验

根据葵花盘蛋白提取单因素实验结果，以料液比（A）、浸提温度（B）、浸提时间（C）、碱液pH（D）为考察因素，以向日葵花盘蛋白提取率的指标，利用正交表L9（34），设计正交实验，实验中各因素水平见表1。

表1 正交试验水平表

1.3.4 葵花盘蛋白酶解

分别选择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，调节溶液pH至酶反应最适pH（如表2所示），对底物浓度为2%葵花盘蛋白水解液进行单酶酶解，每隔30 min测定酶解液的pH，使其始终保持在蛋白酶反应的最适pH，反应时间结束后，于100 ℃灭酶10 min，酶解液于4000 r/min条件下离心15 min，进一步测定上清液抗氧化能力。

表2 酶解反应条件表

1.3.5 葵花盘多肽粗提物抗氧化能力测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

参照JAMDAR等[11]方法，对不同蛋白酶酶解出的葵花盘多肽粗提物的DPPH自由基清除能力进行测定。取样品提取液3 mL及浓度为0.5 mmol/L的DPPH溶液0.25 mL，先后加入到同一试管中，摇匀，避光37 ℃放置20 min，以溶剂为参比，在吸光度514 nm处测定其吸光度为Ai。再取0.5 mmol/L的DPPH溶液0.75 mL与3 mL70%乙醇，一起放入同一试管，摇匀，在避光37 ℃放置20 min，以溶剂为参比，在吸光度514 nm处测定其吸光度A0。分别取葵花盘蛋白酶解液3 mL与70%乙醇0.75 mL放入同一试管中，混匀后避光置于37 ℃恒温箱内反应20 min，以溶剂为参比，在吸光度514 nm处测定其吸光度为Aj。依据DPPH自由基清除率计算公式得出结果。

1.3.5.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定

将浓度为0.05 moL/L的Tris-HCL缓冲溶液4 mL加入到10 mL试管中，置于25 ℃水浴20 min，将样品液和0.2 mmol/L邻苯三酚分别放入水浴锅中预热20 min，并依次向试管中分别加入葵花盘蛋白酶解液1 mL，将试管内溶液混合均匀后于25 ℃水浴锅中，4 min后立即用浓盐酸终止反应[12]。在波长325 nm处测吸光度A1，同时作参比溶液，参比溶液为10 mL试管中加入缓冲溶液4 mL和1 mL样液以及1 mL 0.05 mol/L HCl。对照组用蒸馏水代替，最后依据超氧阴离子清除率计算公式计算得出结果。

2 结果与分析

2.1 向日葵花盘蛋白提取

2.1.1 向日葵花盘粉粗蛋白含量

利用凯氏定氮法对粉碎过筛干燥后的向日葵花盘粉原料粗蛋白进行测定，测定结果为9.19%。

2.1.2 不同料液比对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响

通过图2可看出，料液比对向日葵花盘粗蛋白提取率有一定影响，当料液比在1∶10～1∶30范围内，向日葵花盘粗蛋白提取率随提取液体积的增加而升高，并且提取率差距较明显，而料液比在1∶30～1∶50范围内，提取率略有下降，故选择葵花盘粗蛋白提取料液比1∶30 g/L。

图2 不同料液比对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响图

2.1.3 不同提取温度对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响

通过图3可看出，提取温度对向日葵花盘蛋白质提取率有一定影响，提取温度20～30 ℃范围内，向日葵花盘蛋白提取率增高，在温度30 ℃时达到峰值；而提取温度在30～50 ℃范围内，提取率明显下降，由此可见，高温提取条件下可能会导致葵花盘蛋白变性，故不考虑60 ℃或更高提取温度，选择30 ℃作为最适提取温度。

图3 不同提取温度对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响图

2.1.4 不同提取时间对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响结果

通过图4可看出，浸提时间在10 min～50 min范围内，向日葵花盘粗蛋白提取率先有增加，后缓慢下降，并趋于平缓；在浸提20 min时，达到最大值，故选择20 min为最适提取时间。

图4 不同提取时间对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响图

2.1.5 不同碱液pH对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响结果

通过图5可看出，碱液pH对向日葵花盘蛋白提取率有一定影响，碱液pH9～pH11，向日葵花盘蛋白提取率差距不大；碱液pH11～pH13，向日葵花盘蛋白提取率差异显著，在碱液pH12时达到峰值，故选择pH12为最适提取pH值。

图5 不同碱液pH对向日葵花盘粗蛋白提取率的影响图

2.1.6 葵花盘蛋白提取正交实验分析

正交实验后，本研究找到向日葵花盘粗蛋白最佳提取条件为A3B3C2D2，即料液比1∶35、温度35 ℃、时间20 min、碱液pH12。由表3可知，提取液的pH和料液比对蛋白的提取率有显著性影响。

表3 葵花盘蛋白提取正交实验表

由此可见，向日葵花盘中粗蛋白提取率的影响因素顺序为：提取液pH＞料液比＞浸提时间＞浸提温度。从正交实验中得出的碱提酸沉法最佳条件下提取向日葵花盘中蛋白，其得率为20.23%。

2.2 不同酶解处理后所得向日葵花盘多肽抗氧化能力结果

2.2.1 不同酶解处理后所得向日葵花盘多肽对DPPH·的清除能力

由图6可知，向日葵盘蛋白经不同酶解后，其酶解多肽对DPPH·清除能力存在较明显差异。其中，葵花盘蛋白中性蛋白酶酶解液对DPPH·的清除能力最强，达到23.1%；葵花盘蛋白木瓜蛋白酶酶解液的DPPH·清除能力为10.3%；而碱性蛋白酶处理后的样品的清除能力仅为5.1%。由此可见，在相同条件下，碱性蛋白酶处理后得到的多肽清除DPPH·自由基的能力最弱；中性蛋白酶处理后的多肽对清除DPPH·自由基的能力最强。

图6 不同酶解处理后所得向日葵花盘多肽对DPPH·的清除能力图

2.2.2 超氧阴离子清除能力

由图7中的清除率数值可知，用中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别单独处理葵花盘蛋白后，得到的葵花盘多肽溶液对超氧阴离子清除能力均约为40%，添加木瓜蛋白酶处理后得到的葵花盘多肽溶液，其超氧阴离子自由基清除能力约为前两者的一半，依次为40.03%、39.64%和19.70%[12]。

图7 不同蛋白酶处理后的葵花盘多肽对超氧阴离子自由基的清除能力图

3 结论

本研究以蛋白质提取率为指标，通过正交实验对向日葵花盘粗蛋白进行碱提酸沉法提取工艺优化，并采用考马斯亮蓝法对提取液中蛋白含量进行测定，得到向日葵花盘粗蛋白碱提酸沉最优工艺。随后，分别使用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶，对向日葵花盘蛋白进行酶解，并通过抗氧化实验对酶解液抗氧化能力进行评价。结果显示，上述3种酶解产物均表现出一定的抗氧化能力，其中，中性蛋白酶酶解后得到的葵花盘多肽的抗氧化能力相对突出。因此，本研究可为向日葵花盘抗氧化肽的制备提供理论依据，提高向日葵花盘的利用价值。