MiR-125b-5p靶向BACH1增强β-地中海贫血单核细胞吞噬活性的机制研究

岑红霞 蔡思铭 姜虹羽 廖赵妹

HbE/β-地中海贫血(HbE/β-thal)是一种发病率与死亡率均较高的血液疾病,在全球3亿血红蛋白病患者中,HbE/β-thal约有100万例,患者往往表现出身体发育缺陷、严重的慢性贫血,常因并发心血管疾病和严重感染后死亡[1]。HbE/β-thal患者异常红细胞(red blood cell,RBC)的清除主要是通过活化的单核细胞来实现,是机体防御系统的重要组成部分[2,3]。近年来,miRNA在单核细胞活化和吞噬功能方面的调控作用受到广泛关注。Kuno等[4]研究表明miR-125b在β-thal患者的CD14标记阳性外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中表达水平升高,且其表达量与PBMC的吞噬活性呈正相关,并与贫血严重程度的指标。另一项研究指出miR-125b的表达水平还与巨噬细胞分化及吞噬活性有关[5]。可见miR-125b在活化单核细胞中的表达可能是一种与β-thal患者贫血严重程度相关的遗传修饰,但其作用机制仍不清楚。BTB结构域和CNC同系物1(BTB domain and CNC homolog 1,BACH1)是一种调控多基因表达的血红素结合因子,在血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的调节中起重要作用[6]。HO-1在应激状态下诱导血红素降解,并具有抗炎、抗氧化与凋亡特性,而BACH1是众所周知的HO-1抑制剂[7,8]。血红素-BACH1/HO-1转录激活途径为细胞环境提供了一种保护机制,当血红蛋白产生组装活跃时,在红系分化期间维持平衡的内稳态[9]。Srinoun等[10]研究发现,HbE/β-thal患者PBMC内miR-155表达上调、BACH1表达减少和PBMC吞噬活性增加有关,并指出活化的PBMC中miR-155通过调节BACH-1导致吞噬活性的增强,为HbE/β-thal异常RBC的吞噬清除提供了新的见解。研究发现miR-125b-5p与BACH1存在靶向结合位点,由此推测miR-125b-5p有可能是通过BACH1/HO-1轴增强了单核细胞吞噬功能[10]。为验证该推测,本研究收集了健康儿童与HbE/β-thal患儿的外周血,分离PBMC测定其中miR-125b-5p表达量,分析其与PBMC表型及吞噬活性的关系,并采用体外实验验证miR-125b-5p与BACH1/HO-1轴在HbE/β-thal-PBMC中的作用,以期能进一步丰富对HbE/β-thal疾病发展机制的认识。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院收治的15例HbE/β-thal患儿作为研究对象,均经基因检测、血红蛋白分析等实验室检查首次诊断为HbE/β-thal,未接受过输血与切除术等治疗,年龄≤16岁。另外选取15例健康儿童作为对照,所有参与研究的儿童家长知情并同意。本研究已通过我院伦理委员会审批。2组儿童年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05),HbE/β-thal患儿RBC、Hb、Hct、MCV、MCH均低于健康儿童(P<0.05),而RDW高于健康儿童(P<0.05)。见表1。

表1 2组受试者临床资料比较 n=15,

1.2 细胞与试剂 HEK293细胞及RPMI1640培养基购自美国赛默飞公司,10% FBS 购自美国GIBCO公司,Lipofectamine 2000转染试剂盒、CFSE 购自美国Invitrogen公司,Ficoll-Paque淋巴细胞分离液购自美国GE公司,CD14/CD16微珠购自德国Miltenyi公司, RT-PCR试剂、2×qPCR MasterMix Plus定量PCR试剂、miScript II RT 试剂盒、miScript SYBR green PCR试剂均购自德国Qiagen公司,BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物公司,荧光素酶报告基因系统购自北京普洛麦格公司。

1.3 方法

1.3.1 实验室检测:收集所有参与研究儿童在空腹状态下的外周静脉血于EDTA管,使用全自动血液分析仪(迈瑞BC-30)检查血常规,包括RBC数量、红细胞压积(hematocrit,Hct)、平均红细胞体积(mean red blood cell volume,MCV)、平均血红蛋白含量(Mean hemoglobin content,MCH)、红细胞体积分布宽度(red blood corpuscular volume distribution width,RDW)、单核细胞计数等参数。血液涂片采用吉姆萨染色并用光学显微镜分析。

1.3.2 细胞分离:取EDTA管血样在3 000 r/min离心5 min,从中分离棕黄血沉层和成熟RBC,采用密度梯度离心法分离PBMC,将血液用RPMI 1640培养基按1∶1稀释,室温下在Ficoll上分层,400 g离心30 min,去上清,重悬细胞,400～500 g离心 15 min后去上清,重复2次,得到PBMC。通过CD14/CD16微珠与全自动磁细胞分选仪MACS(德国Miltenyi公司)从PBMC中分离CD14+CD16+单核细胞。

1.3.3 流式细胞仪测定细胞表型:将PBMC采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬,并调整细胞浓度为1×106/ml,分别加入Qdot 605-CD14、PE-Cy7-CD16抗体充分混匀后于4℃孵育30 min,PBS洗涤后加入缓冲液重悬,采用LSR-II-Fortessa流式细胞仪(美国BD生物公司)基于CD14与CD16标记对PBMC进行分型:CD14hiCD16-、CD14hiCD16+与CD14lowCD16+ 。

1.3.4 QRT-PCR:TRIzol试剂提取总RNA,miR-125b-5p使用miScript Ⅱ RT试剂盒进行反转录、miScript SYBR green PCR试剂盒进行定量PCR检测,BACH1 mRNA使用 RT-PCR试剂、2×qPCR MasterMix Plus 试剂进行PCR检测,于荧光定量PCR仪7500(美国ABI公司)上采集数据,采用2-ΔΔct的方法计算miR-125b-5p、BACH1 mRNA 的相对表达量。

1.3.5 荧光素酶报告基因系统:将突变/野生型 BACH1 mRNA 3′UTR区域载入pMIR报告质粒的HindⅢ SpeI限制位点,将0.2 μg萤火虫荧光素酶报告质粒、0.2 μg含有Renilla荧光素酶的对照载体及50 nmol miR-125b-5p mimic/NC mimic共转染至3×105个/ml的HEK293细胞中24 h,以Renilla荧光素酶活性作为内参,计算相对荧光素酶活性。

1.3.6 Western blot:RIPA液裂解细胞,BCA法测定蛋白浓度,取定量蛋白进行蛋白凝胶电泳,转膜后使用丽春红染色,5%脱脂奶粉封闭,加入一抗(抗BACH1/HO-1抗体)于4℃孵育过夜,使用凝胶成像分析仪WD-9413A(北京六一仪器厂)拍照并定量分析。

1.3.7 细胞转染:使用Lipofectamine 2000转染试剂盒将NC mimic、miR-125b-5p mimic、pcDNA、pcDNA-BACH1分别转染至健康儿童来源的CD14+ CD16+ 型PBMC中, NC inhibitor、miR-125b-5p inhibitor、siRNA、siRNA-BACH1分别转染至HbE/β-thal患儿来源的CD14+ CD16+ 型PBMC中,转染48 h后测定细胞内BACH1 mRNA表达量以确定转染是否成功。

1.3.8 PBMC对RBC吞噬活性的测定:取1×106/ml的PBMC细胞培养于添加了1%牛血清白蛋白RPMI1640培养基内16 h,洗去未粘附细胞,将贴壁细胞以1×104/孔接种于96孔板,加入200 μl/孔培养基,37℃、5% CO2培养1 h,随后取2 × 105个/孔的正常成熟RBC(以20 μmol/L的CFSE探针标记)覆盖培养2 h,加入生物素标记抗CD14孵育30 min,使用LSR-II-Fortessa流式细胞仪分析数据,检测吞噬活性为双阳性荧光。

2 结果

2.1 HbE/β-thal患儿PBMC激活表型特征 收集15名健康儿童与15例HbE/β-thal初诊患儿的外周静脉血,血液涂片染色后于显微镜下观察,发现健康儿童外周血内RBC呈大小均一的圆形,未见单核细胞吞噬现象,而HbE/β-thal患儿外周血内存在较多大小不等、形态异常RBC,且偶见单核细胞吞噬现象。健康儿童外周血单核细胞计数为(1.06±0.49)×109/L,HbE/β-thal患儿为(1.24±0.44)×109/L,2组差异无统计学意义(P>0.05),但与健康儿童比较,HbE/β-tha患儿CD14hiCD16+表型PBMC比例增加(P<0.05),CD14hiCD16-与CD14lowCD16+表型PBMC比例无明显变化(P>0.05)。表明,HbE/β-thal患儿存在外周血CD14hiCD16+型PBMC激活现象。见图1。

图1 HbE/β-thal患儿PBMC激活表型特征;A健康儿童与HbE/β-thal患儿血液涂片观察;B健康儿童与HbE/β-thal患儿外周血中单核细胞计数;C流式细胞仪分析PBMC表型;D-F健康儿童与HbE/β-thal患儿CD14hiCD16-(D)、CD14hiCD16+(E)与CD14lowCD16+(F)表型PBMC比例的比较

2.2 HbE/β-thal患儿PBMC内miR-125b-5p表达情况分析 HbE/β-thal患儿PBMC内miR-125b-5p表达量显著高于健康儿童(P<0.05);进一步分析miR-125b-5p表达量与HbE/β-thal患儿病情参数及PBMC激活表型的关系,结果发现,miR-125b-5p的表达与RBC计数、Hb含量、Hct、MCH均呈负相关(P<0.05),而与CD14hiCD16+比例呈现正相关(P<0.05)。HbE/β-thal患儿PBMC内miR-125b-5p表达上调,与HbE/β-thal患儿贫血严重程度及激活的单核细胞密切相关。见图2。

图2 HbE/β-thal患儿PBMC内miR-125b-5p表达情况分析;A qRT-PCR检测HbE/β-thal患儿PBMC内miR-125b-5p表达; B～H HbE/β-thal患儿PBMC内miR-125b-5p表达量与RBC计数(B)、Hb含量(C)、Hct(D)、MCV(E)、MCH(F)、RDW(G)、CD14hiCD16+比例(H)的关系

2.3 MiR-125b-5p与BACH1的靶向关系分析 miR-125b-5p与BACH1 mRNA 3’ UTR存在靶向结合位点,于是针对该靶点设计突变序列,双荧光素酶报告基因系统验证该靶向关系,结果显示,带靶点突变序列的BACH1 与miR-125b-5p共转染未降低荧光素酶活性(P>0.05),而野生型BACH1 与miR-125b-5p共转染显著降低了荧光素酶活性(P<0.05);采用miR-125b-5p mimic和miR-125b-5p inhibitor转染HEK293细胞,结果显示,miR-125b-5p mimic能抑制BACH1表达(P<0.05),而miR-125b-5p inhibitor增强了BACH1表达(P<0.05)。随后检测了2组儿童PBMC中BACH1与其下游效应蛋白HO-1的表达量,结果显示,与正常儿童比较,HbE/β-thal患儿PBMC中BACH1表达量降低(P<0.05),而HO-1表达量升高(P<0.05)。推测,miR-125b-5p可能通过BACH1/HO-1轴影响PBMC的激活。见图3,表2～4。

图3 MiR-125b-5p与BACH1的靶向关系分析;A Starbase 分析miR-125b-5p与BACH1 mRMA的靶向关系;B Western blot法测定miR-125b-5p mimic转染HEK293细胞对BACH1表达的影响;C Western blot法测定miR-125b-5p inhibitor转染HEK293细胞对BACH1表达的影响;D Western blot法测定2组儿童PBMC中BACH1与HO-1表达量

表2 双荧光素酶报告基因系统实验结果

表3 miR-125 mimic与inhibitor对HEK293细胞中BACH1表达的影响

表4 2组儿童PBMC中BACH1与HO-1表达量比较 n=15,

2.4 MiR-125b-5p通过抑制BACH1增强HbE/β-thal患儿单核细胞吞噬活性 将miR-125b-5p mimic、pcDNA-BACH1转染从健康儿童获取的CD14hiCD16+型单核细胞,miR-125b-5p mimic抑制了BACH1 mRNA表达(P<0.05),并提高了HO-1的表达量(P<0.05),而pcDNA-BACH1的转染抵消了miR-125b-5p mimic的作用(P<0.05);与此同时,将miR-125b-5p inhibitor、siRNA-BACH1转染HbE/β-thal患儿获取的CD14hiCD16+型单核细胞,miR-125b-5p inhibitor增加了BACH1 mRNA表达(P<0.05),进而抑制了HO-1的表达(P<0.05),siRNA-BACH1转染也能抵消miR-125b-5p inhibitor的作用。随后检测其两类细胞对RBC的吞噬情况,结果显示,miR-125b-5p mimic可以显著增强健康儿童来源单核细胞对RBC的吞噬能力(P<0.05),而pcDNA-BACH1能逆转该情况(P<0.05),同时miR-125b-5p inhibitor降低了具有高吞噬能力的HbE/β-thal患儿来源单核细胞对RBC的摄取能力(P<0.05),而siRNA-BACH1也能逆转该现象(P<0.05)。由此可见miR-125b-5p通过抑制BACH1来增强HbE/β-thal患儿单核细胞吞噬活性。见图4,表5、6。

图4 MiR-125b-5p通过抑制BACH1增强HbE/β-thal患儿单核细胞吞噬活性;A Western blot检测细胞HO-1蛋白表达量;B 流式细胞仪分析各组细胞的CD14/CFSE标记

表5 单核细胞中HO-1表达与CD14/CFSE标记比较

表6 单核细胞中BACH1 mRNA表达量比较

3 讨论

单核细胞通过感知局部环境清除病原体与死亡细胞、启动适应性免疫、补充巨噬细胞,在炎症与免疫防御的平衡中发挥了重要作用[11]。单核细胞能被异常RBC来源血红素诱导发展为铁循环巨噬细胞,并在与模式识别受体结合后激活,清除衰老和异常的RBC[12,13]。

单核细胞具有异质性与分化可塑性,可以根据环境和/或接触特定病原体后诱发的免疫反应改变表型[14]。本研究中着重探讨了miRNA-125b-5p对HbE/β-tha患儿中PBMC细胞表型及吞噬活性影响的机制。结果显示,健康儿童与HbE/β-tha患儿PBMC数量上没有明显差异,但HbE/β-tha患儿CD14hiCD16+表型PBMC比例增加。人类单核细胞被分为了三种亚型:其中经典亚型CD14hiCD16-占据PBMC的80%～90%,中间亚型CD14hiCD16+与非经典亚型CD14lowCD16+约占5%～10%[15,16]。CD14hiCD16+是具有较高的抗原递呈能力,参与感染与炎症的发展调控,同时具有促炎、吞噬及抗炎的作用,该表型PBMC比例的增加表示患儿体内炎症水平上升[17-19]。HbE/β-thal患儿PBMC内miR-125b-5p表达量显著高于健康儿童,相关性分析显示miR-125b-5p的表达与RBC计数、Hb含量、Hct、MCH均呈负相关,这些指标均表示的是贫血的严重程度,说明miR-125b-5p表达量随着贫血严重程度的增加而增加;而miR-125b-5p表达与CD14hiCD16+比例呈现正相关,提示miR-125b-5p的表达可能参与了CD14hiCD16+表型PBMC的激活。

随后研究证实了miR-125b-5p能靶向抑制BACH1表达,且在HbE/β-thal患儿PBMC中也能抑制BACH1表达,而激活HO-1表达。HO-1已被确认具有主要的免疫调节和抗炎特性,而BACH1是HO-1转录的关键抑制蛋白,因此miR-125b-5p可以间接上调HO-1表达[20-22]。同时研究观察到,miR-125b-5p上调可以显著增强健康儿童来源PBMC的吞噬能力,而同时上调BACH1能逆转该情况,相反地,抑制miR-125b-5p能降低具有高吞噬能力的HbE/β-thal患儿来源PBMC的吞噬活性,而抑制BACH1能逆转该现象。双向回复实验证实了miR-125b-5p是通过抑制BACH1、上调HO-1来激活HbE/β-thal患儿CD14hiCD16+表型PBMC、并增强吞噬活性。

综上所述,miR-125b-5p通过抑制BACH1来增强HbE/β-thal患儿单核细胞吞噬活性。但由于单核细胞吞噬在HbE/β-thal中存在双重作用:维持机体局部环境稳定和可能造成溶血,如何通过上述靶标调控PBMC吞噬活性并维持双向平衡还有待研究。