银杏素调节NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路对高糖诱导肾小球内皮细胞焦亡的影响

温洁 高颖颖

糖尿病肾病是糖尿病中最常见的微血管并发症,也是终末期肾病的主要原因[1]。肾小球是糖尿病肾脏损伤的主要部位,进行性糖尿病肾病导致肾小球高滤过以及细胞外基质产生和组成改变,进而导致系膜基质扩张和肾小球基底膜厚度增加,从而减少肾小球滤过表面积[2]。肾小球内皮细胞是肾小球滤过屏障的一个重要组成部分,高糖条件下肾小球内皮细胞的功能障碍是引起糖尿病肾病的关键因素[3]。因此减轻高糖条件下肾小球内皮细胞损伤可作为治疗糖尿病肾病的一个有潜力的方法。银杏素是从银杏叶中提取的一种常见的天然无毒双黄酮物质,已被证实具有多种生物功能,如抗癌、抗肥胖、抗炎、氧化应激和神经保护的功效[4]。Zhang等[5]研究发现银杏素可通过抑制体内炎性反应,肾损伤以及肾小管凋亡减轻LPS诱导的小鼠急性肾损伤。另外,已有研究发现银杏素可通过抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖和氧化应激,减少细胞外基质沉淀,并通过激活AMPk/mTOR介导的自噬途径减轻肾小球系膜细胞功能障碍而缓解糖尿病肾病的进展,提示其可作为一种有前途的糖尿病肾病治疗剂[6]。焦亡是一种半胱天冬酶-1(caspase-1)依赖的程序性细胞死亡,由炎症小体启动[7]。核转录因子кB/Nod样受体蛋白3/半胱天冬酶-1(NF-κB/NLRP3/Caspase-1)信号通路在焦亡过程中起重要作用,NF-κB通过诱导NLRP3表达来引发炎症小体的激活[8]。活化的NLRP3诱导caspase-1裂解为活化的caspase-1,进而驱动促炎细胞因子IL-1β和IL-18的产生,然后诱发焦亡[9]。Duan等[10]也发现Swietenine可抑制NF-κB/NLRP3/ caspase-1信号通路介导的焦亡减轻糖尿病肾病小鼠炎症和氧化应激,从而改善糖尿病肾病,提示NF-κB/NLRP3/ caspase-1信号通路参与糖尿病肾病的发生发展。在高糖条件模拟糖尿病肾病体外环境,观察银杏素减轻肾小球内皮细胞损伤和焦亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肾小球内皮细胞(HRGECs)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。银杏素(CFN90173)购自武汉中标科技有限公司;NF-κB抑制剂BAY 11-7085(HY-10257)、NLRP3抑制剂(HY-12815)、Caspase-1抑制剂VX-765(HY-13205)购自MCE公司;FAM FLICATMCaspase-1 Kit(ICT098)购自Bio-Rad公司;抗体NF-κB p65(ab16502)、Caspase-1(ab207802)、GSDMD(ab209845)、NLRP3(ab263899)、GAPDH(ab8245)、HRP偶联的二抗(ab6721)购自英国abcam公司。

1.2 细胞培养与分组 将HRGECs细胞生长在含10%胎牛血清和1%双抗的内皮生长培养基中,在37℃含5%CO2细胞培养箱中培养,传3代后进行实验。将传代后的细胞分为正常组(正常5 mmol/L葡萄糖)、高糖组[11](30 mmol/L葡萄糖)、银杏素低剂量组[6](30 mmol/L葡萄糖+5 μmol/L银杏素)、银杏素中剂量组(30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L银杏素)、银杏素高剂量组(30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L银杏素)、BAY组[12](30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L银杏素+2.5 μmol/L NF-κB的特异性抑制剂BAY 11-7085(BAY))、MCC950组[13](30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L银杏素+10 μmol/L NLRP3抑制剂MCC950)、VX-765组[12](30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L银杏素+20 μmol/L Caspase-1抑制剂VX-765),8组细胞加入相应试剂后共培养24 h。

1.3 MTT法检测细胞存活率 将HRGECs细胞以1×104个/孔的密度接种到96孔细胞板培养24 h后,加入8组细胞培养液培养24 h后,向每个孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),并继续孵育4 h。然后除去培养基,向每个孔中加入150 μl DMSO以充分溶解紫色结晶,使用酶标仪记录490 nm波长下的吸光度值(OD值),计算细胞存活率。

1.4 流式细胞术检测细胞焦亡情况 收集8组细胞,PBS洗涤细胞后,根据试剂盒说明书,加入5 μl Caspase-1-FLICA避光孵育1 h,然后加入5 μl PI染液避光孵育15 min,流式细胞仪检测细胞焦亡。

1.5 试剂盒法测定细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平 通过ELISA试剂盒检测细胞上清IL-1β、IL-18水平,使用LDH试剂盒检测LDH释放水平,所有具体操作步骤严格按照各自试剂盒进行。

1.6 qRT-PCR法检测细胞NF-κB、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表达 收集8组细胞,加入TRIzol试剂从细胞中提取总RNA,检测总RNA浓度和纯度。使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA,然后进行PCR反应。GAPDH为内参基因,PCR条件为:95℃ 30 s, 95℃ 5 s,60℃ 30 s共40个循环。最后,采用2-ΔΔCt法分析NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1基因相对表达水平。见表1。

1.7 Western blot检测细胞蛋白表达情况 收集8组细胞,用PBS洗涤3次后加入RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白,使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质上样后由10%SDS-PAGE凝胶电泳分离,随后转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶封闭2 h后加入一抗p-NF-κB p65、NF-κB p65、Cleaved caspase-1、Caspase-1、GSDMD、NLRP3和GAPDH在4℃下孵育过夜,随后,将膜与二抗在室温下孵育1 h,加入ECL试剂显影, Image J软件量化蛋白条带。

2 结果

2.1 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞存活率的影响 与正常组比较,高糖组细胞存活率明显下降(P<0.05);与高糖组比较,银杏素低、中、高剂量组细胞存活率明显升高(P<0.05);与银杏素高剂量组比较,BAY组、MCC950组、VX-765组细胞存活率进一步升高(P<0.05)。见表2。

表2 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞存活率的影响 n=6,%,

2.2 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞焦亡的影响 与正常组比较,高糖组细胞PI+ Caspase-1阳性细胞比例明显升高(P<0.05);与高糖组比较,银杏素低、中、高剂量组细胞PI+ Caspase-1阳性细胞比例明显降低(P<0.05);与银杏素高剂量组比较,BAY组、MCC950组、VX-765组细胞PI+ Caspase-1阳性细胞比例进一步降低(P<0.05)。见表3,图1。

图1 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞焦亡的影响

表3 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞焦亡的影响

2.3 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平的影响 与正常组比较,高糖组细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平明显升高(P<0.05);与高糖组比较,银杏素低、中、高剂量组细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与银杏素高剂量组比较,BAY组、MCC950组、VX-765组细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平进一步降低(P<0.05)。见表4。

表4 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平的影响

2.4 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表达影响 与正常组比较,高糖组细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较,银杏素低、中、高剂量组细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与银杏素高剂量组比较,BAY组、MCC950组和VX-765组细胞Caspase-1 mRNA表达水平进一步降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表达影响

2.5 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达影响 与正常组比较,高糖组细胞p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved caspase-1、 GSDMD蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与高糖组比较,银杏素低、中、高剂量组细胞p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与银杏素高剂量组比较,BAY组细胞p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表达水平进一步降低(P<0.05),MCC950组细胞NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表达水平进一步降低(P<0.05),VX-765组细胞Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表达水平进一步降低(P<0.05)。见图2,表6。

图2 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达

表6 银杏素对高糖诱导的HRGECs细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达影响

3 讨论

肾小球内皮细胞位于肾小球毛细血管的最内层,易受血糖、血脂、炎症刺激等因素的损伤[14]。高糖环境中肾小球内皮细胞功能障碍与糖尿病肾病发生发展密切相关[15]。多项研究已表明,高糖条件下会抑制肾小球内皮细胞的增殖并诱导促炎因子的释放进而加重内皮损伤[16,17]。高糖诱导的体外肾小球内皮细胞损伤方法已被大多数研究人员证实可模拟糖尿病肾病环境[18]。本研究结果同样显示高糖条件下明显抑制肾小球内皮细胞增殖情况,促炎因子IL-1β、IL-18水平明显升高,表明高糖诱导的肾小球内皮细胞模型构建成功。

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡,并伴随着促炎因子的释放[19]。NF-κB是炎症、应激反应以及细胞生长和存活的关键转录因子,高糖条件下增强细胞中氧化应激,诱导NF-κB介导的炎性级联反应[20]。有研究发现,NF-κB途径激活诱导NLRP3的产生,NLRP3反过来触发Caspase-1的募集,形成激活Caspase-1发生裂解,并促进GSDMD的活化以及IL-1β和IL-18的产生[21]。值得注意的是,IL-1β和IL-18是有效的促炎细胞因子,通过诱导其他促炎细胞因子和粘附分子的表达来加重炎性反应[22]。Gu等[19]也研究发现丁酸钠可通过抑制NF-κB/Caspase-1信号通路降低高糖诱导的肾小球内皮细胞炎性因子表达,抑制细胞焦亡。另有研究报道称NLRP3 炎症小体激活可诱发肾小球炎症和肾小球内皮细胞损伤,从而引发肾小球损伤[23]。Jiang等[24]也研究发现维生素D可下调NF-κB p65、NLRP3、Cleaved Caspase-1蛋白表达,通过抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路介导的焦亡缓解肾小球内皮细胞损伤。本研究结果发现经高糖诱导后,肾小球内皮细胞PI+Caspase-1阳性细胞比例、p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved Caspase-1以及GSDMD蛋白表达明显升高,表明高糖会诱导肾小球内皮细胞发生焦亡,此研究结果与Song等[25]研究一致。另外,使用银杏素干预后,增加了处于高糖条件下肾小球内皮细胞的存活率,抑制细胞IL-1β、IL-18和LDH的释放、PI+ Caspase-1阳性细胞比例以及p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved Caspase-1和GSDMD的蛋白表达,提示银杏素可通过抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路抑制高糖诱导的肾小球内皮细胞焦亡。分别使用NF-κB、NLRP3、Caspase-1特性性抑制剂BAY、MCC950、VX-765,结果发现BAY、MCC950、VX-765进一步抑制肾小球内皮细胞发生焦亡,证实银杏素可通过抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路抑制高糖诱导的肾小球内皮细胞焦亡。

综上所述,本研究发现银杏素促进高糖条件下肾小球内皮细胞增殖,通过抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路介导的细胞焦亡减轻肾小球内皮细胞损伤。本研究仅从体外细胞层面研究发现银杏素可通过NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路介导的细胞焦亡发挥抗炎作用,后续本研究将进一步通过体内动物实验进一步验证银杏素作用机制,为银杏素治疗糖尿病肾病提供有力的实验基础和理论依据。