Numb调控ITGB1促进胃癌细胞对多柔比星敏感性的机制研究

陈勇 何冬雷 周江浩 梁月祥 杨丞

胃癌作为全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症相关死亡原因,手术是其唯一的根治性疗法[1]。目前随着手术技术的提高,早期胃癌患者5年生存率可达95%以上[2]。然而,胃癌患者的早期诊断率仍较低,意味着大多数患者在确诊时已处于晚期,错过了最佳手术期。晚期胃癌的主要治疗方法是新辅助放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗相结合,化疗与靶向治疗的联合使用明显延长了晚期胃癌患者的总生存期和生活质量[3]。然而,胃癌细胞对化疗药物耐药性的出现是临床治疗中的主要障碍,这可能导致预后不良。Numb是一种在哺乳动物组织中广泛表达的进化上保守的蛋白质,具有多种功能,例如调控细胞不对称自我更新、分裂、增殖、迁移以及其他信号通路[4]。研究表明,Numb可能在各种肿瘤类型中发挥抑癌作用,例如肺癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌等[5-8]。此外,已有研究表明,Numb在胃癌组织中表达水平下调,其可作为一种潜在的抑癌基因并用于胃癌诊断中[9]。但关于其是否对包括胃癌在内的恶性肿瘤细胞的化疗敏感性产生影响笔者却未见报道。鉴于此,本研究在检测胃癌患者肿瘤组织内Numb表达变化的基础上,进一步探究了Numb对化疗药物多柔比星(adriamycin,ADR)诱导胃癌细胞凋亡敏感性的影响以及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人胃癌细胞株SGC-7901(武汉华尔纳生物科技有限公司),多柔比星(ADR)(美国Sigma公司),胎牛血清、胰酶、RPMI 1640培养液及Polybrene(美国Gibco公司),Trizol、cDNA第一链合成试剂盒及荧光定量检测试剂盒(日本Takara公司),Hoechst 33342染液(上海钰博生物科技有限公司),Annexin V/FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京诺唯赞生物公司),RIPA裂解液、NP40裂解液和ECL发光液(上海碧云天生物研究所),PVDF膜(美国Millipore公司),BCA蛋白测定试剂盒(上海翊圣有限公司),Protein A+G Agarose(上海联迈生物公司),一抗抗体Numb、ITGB1、P-gp、PARP、Cleaved-caspase3及Cleaved-caspase9(英国Abcam公司),GAPDH抗体与二抗抗体辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)。阴性对照慢病毒与Numb过表达慢病毒由上海吉玛生物技术有限公司完成载体构建、包装及滴度测定。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染:在SGC-7901细胞中添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液并培养于37℃、5%CO2恒温箱内,常规传代培养。将细胞按照2×104个/孔接种在96孔板上,过夜培养后,分别将阴性对照慢病毒、Numb过表达慢病毒感染至SGC-7901细胞,感染复数设为100,并添加Polybrene增强感染效果,12 h后,更换为新鲜配制的培养液培养,通过2 μg/ml嘌呤霉素进行筛选,获得稳转SGC-7901细胞株。

1.2.2 Hoechst 33258染色:将SGC-7901细胞随机分为4组进行处理:①对照组:SGC-7901细胞正常培养;②ADR组:使用100 nmol/L ADR处理SGC-7901细胞;③pLVX-Numb组:将Numb过表达慢病毒感染至SGC-7901细胞;④pLVX-Numb+ADR组:将Numb过表达慢病毒感染至SGC-7901细胞,再用100 nmol/L ADR处理该细胞。48 h后收集上述4组细胞,常规消化、离心,PBS重悬清洗细胞,加入5 mg/L的Hoechst 33342染液,置于37℃条件下避光孵育30 min,PBS再次洗涤细胞,离心并重悬,取适量细胞混悬液制片,在荧光显微镜下观察细胞结构改变情况。

1.2.3 流式细胞术:收集细胞后常规消化、离心,PBS清洗,使用1×binding buffer重悬,调节密度为1×106个/ml,吸取100 μl悬液置于流式检测管中,在管内加入5 μl Annexin V/FITC与10 μl碘化丙锭,震荡混匀,室温孵育10 min,立即通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.2.4 Western blot法:在细胞中加RIPA裂解液提取上清,即获得蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取等量40 μg蛋白经过10%SDS-PAGE电泳分离,电转至PVDF膜,浸入5%脱脂奶粉封闭2 h。滴加稀释的一抗,4℃孵育过夜。次日,TBST洗膜,将膜与HRP 标记的二抗在室温下共孵育1 h,TBST再次洗膜,ECL显影、曝光,Image-Pro Plus 6.0软件分析蛋白质灰度值,选择GAPDH抗体作为内参蛋白,以目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应:Trizol法提取细胞的总RNA,NanoDrop2000系统测定RNA浓度与纯度。去除RNA中的gDNA后,参照cDNA第一链合成试剂盒说明书操作合成cDNA,保存于-20℃条件下。qRT-PCR实验根据荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)说明书步骤进行,以cDNA为模板,配制扩增反应体系,在Bio-CFX96系统上测定,实验重复3次。结果根据2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量,以内参基因GAPDH对表达水平进行归一化处理。

1.2.6 免疫共沉淀实验:在细胞中加入NP40裂解液冰上裂解30 min,置于离心机上以12 000 r/min低温离心20 min,吸取上清,移入干净离心管内,加入Protein A+G Agarose,4℃条件下封闭2 h,排除非特异性结合蛋白。以12 000 r/min低温离心10 min,吸取上清,加入ITGB1一抗抗体,IgG中加入等量同源IgG抗体,4℃条件下孵育过夜。次日,加入Protein A+G Agarose,4℃条件下继续孵育4 h,以捕捉抗原-抗体复合物。再以12 000 r/min低温离心10 min,弃去上清并保留沉淀,添加NP40蛋白洗脱液后离心,重复洗脱一次,加入上样缓冲液,混匀,将蛋白加热煮沸变性,通过Western blot实验进行检测。

2 结果

2.1 Numb对多柔比星处理下胃癌细胞凋亡的影响

2.1.1 荧光显微镜下观察:对照组的SGC-7901细胞胞核外围轮廓较为清晰,并且形态、大小一致,无明显核浓缩现象;ADR组和pLVX-Numb组细胞出现较多浓缩、碎裂的蓝色凋亡体,说明细胞凋亡数目较多;pLVX-Numb+ADR组中核浓缩与碎裂的细胞较pLVX-Numb组进一步增加,说明该组细胞凋亡数目更多。见图1。

图1 4组SGC-7901细胞凋亡形态观察(Hoechst 33258染色×100)

2.1.2 与对照组比较,ADR组和pLVX-Numb组的细胞凋亡率均显著增加(P<0.05);与ADR组比较,pLVX-Numb+ADR组细胞凋亡率则又显著增加(P<0.05)。见图2,表1。

表1 4组SGC-7901细胞凋亡率比较 %,

图2 4组SGC-7901细胞凋亡率比较

2.2 Numb对多柔比星处理下胃癌细胞耐药蛋白与凋亡相关蛋白的表达影响 与对照组比较,ADR组和pLVX-Numb组细胞内P-gp和PARP蛋白相对表达量显著下调(P<0.05),Cleaved-caspase3与Cleaved-caspase9蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05);pLVX-Numb+ADR组细胞P-gp和PARP蛋白相对表达量又显著低于ADR组(P<0.05),Cleaved-caspase3与Cleaved-caspase9蛋白相对表达量均显著高于ADR组(P<0.05)。见图3,表2。

表2 4组SGC-7901细胞中P-gp、PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达比较

图3 4组SGC-7901细胞中P-gp、PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白条带

2.3 Numb1在蛋白翻译后水平上调控ITGB1的表达 对照组、pLVX-NC组及pLVX-Numb组的SGC-7901细胞中ITGB1 mRNA相对表达量间无统计学差异(P>0.05)。但pLVX-Numb组的SGC-7901细胞中ITGB1 蛋白相对表达量显著低于对照组和pLVX-NC组的细胞中ITGB1 蛋白相对表达量(P<0.05)。SGC-7901细胞中内源性Numb与内源性ITGB1能够形成复合物,发生免疫共沉淀;与对照组比较,pLVX-Numb组细胞中ITGB1蛋白泛素链明显增强,说明过表达Numb增加了ITGB1的泛素化水平。见表3,图4、5。

表3 3组SGC-7901细胞中ITGB1 mRNA与蛋白表达比较

图4 3组SGC-7901细胞中ITGB1蛋白条带

3 讨论

Numb定位于极化上皮细胞的基底层,介导细胞膜蛋白的内吞作用和内吞转运,并涉及细胞多种生物学过程。越来越多的研究揭示了Numb与癌症发展之间的关联,在各种癌症类型中Numb表达降低甚至缺失,且这一现象与促进肿瘤生长、侵袭、转移和干性维持等密切相关[10,11]。

已有研究表明,SRPK2通过负调控Numb和p53在结直肠癌中促进细胞迁移和侵袭,并降低结直肠癌细胞对吉西他滨或奥沙利铂治疗的化学敏感性[12],这一结果提示,Numb表达下调可能与化疗敏感性降低也相关。本研究结果显示,在胃癌细胞中提高Numb表达可增强ADR处理下的细胞增殖抑制率,并促进ADR诱导的细胞凋亡,抑制细胞内P-gp和PARP蛋白表达并促进Cleaved-caspase3与Cleaved-caspase9蛋白表达。

P-gp作为由多药耐药基因编码的高分子量糖蛋白,其过表达是产生耐药的重要原因之一,P-gp进入肿瘤细胞后与化疗药物分子结合,利用ATP水解产生的能量将药物泵出细胞,从而降低细胞内药物浓度,抑制肿瘤细胞的化疗敏感性[13]。

PARP在DNA损伤后被激活,可结合到DNA断裂部位,参与DNA双链损伤修复,目前以PARP为靶点开发抑制剂来诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗肿瘤的潜在治疗策略[14]。化疗药物通过作用于肿瘤细胞内DNA、酶及蛋白等靶分子来诱导细胞凋亡,该作用依赖于Caspase途径,因此,肿瘤细胞在化疗过程中出现凋亡机制受阻亦可降低化疗敏感性,Cleaved-caspase3与Cleaved-caspase9是影响细胞凋亡的关键蛋白酶,其切割水平可以反映细胞凋亡情况[15]。由此推测,Numb能够促进ADR诱导的胃癌细胞凋亡,提高胃癌细胞对ADR的化疗敏感性。

ITGB1是构成整合素的最大亚家族成员,是参与多种生理和病理生理过程的细胞表面受体,并且越来越多的证据表明,ITGB1在多种癌症类型中有异常表达,并通过介导细胞迁移、侵袭、存活以及凋亡促进肿瘤的恶性表型[16,17]。此外,ITGB1还被发现介导肿瘤细胞对多种抗癌药物的耐药性产生,例如,ITGB1通过介导Cdc42 激活PI3K/p110β 信号传导途径促进胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性[18];另有证据表明抑制 ITGB1能够增强西妥昔单抗对结直肠癌细胞增殖的抑制作用,提高结直肠癌细胞对西妥昔单抗的敏感性进而促进细胞凋亡[19]。

本研究发现ITGB1不仅在胃癌组织内高表达,且在胃癌细胞中提高Numb表达后抑制了ITGB1表达,进一步发现细胞内源性Numb与ITGB1能够形成复合物,此外,过表达Numb增加了ITGB1的泛素化水平而降低ITGB1蛋白表达水平。该结果提示,Numb提高胃癌细胞对ADR敏感性的作用可能与其介导调控ITGB1蛋白表达相关。

综上所述,本研究证实Numb能够增强ADR对胃癌细胞增殖的抑制作用,促进ADR诱导的胃癌细胞凋亡,从而提高了胃癌细胞对ADR敏感性,且Numb可以调控ITGB1蛋白表达水平,这可能与其发挥的作用相关。本实验为提高胃癌化疗敏感性的临床治疗提供了一个新靶点。