苦荞糖基转移酶基因FtUGT143的克隆及表达分析

王佳蕊 孙培媛 柯瑾 冉彬 李洪有

（1. 贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵阳 550001；2. 贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550025）

类黄酮化合物是一类广泛存在于植物中的次生代谢物，在植物生长发育、生物与非生物胁迫抵抗中起着至关重要的作用［1-2]。此外，类黄酮化合物还具有降“三高”、消炎、抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗糖尿病、抗癌防癌等多种保健功能［3-4]。根据化学结构差异，将类黄酮化合物分为黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇和花青素六大类［5]。在植物中，大多数类黄酮化合物以糖苷类化合物形式存在。通常，植物中类黄酮化合物的糖基化由糖基转移酶催化完成，糖基化的位置主要发生在3-O位或7-O位，少部分也发生在5-O位和4'-O位。此外，还有少部分类黄酮化合物直接在苯环上的6-C位或8-C位发生糖基化，这类化合物称为类黄酮C-糖苷［5]。

目前，植物中已报道的类黄酮C-糖苷主要有牡荆素（芹菜素-8-C-葡萄糖苷）、异牡荆素（芹菜素-6-C-葡萄糖苷）、荭草素（木犀草素-8-C-葡萄糖苷）、异荭草素（木犀草素-6-C-葡萄糖苷）等［6]。它们在植物中具有较强的生物活性，不易水解，对植物生长和发育、非生物和生物胁迫的响应以及环境防御等发挥的作用［7]。在植物中，类黄酮C-糖苷的生物合成主要是在C-糖基转移酶的催化作用下，直接将糖基供体转移到底物黄酮的苯环骨架的C上。目前，在植物中已有多个C-糖基转移酶被鉴定［6]。He等［8]在金莲花（Trollius chinensis Bunge）中鉴定到的C-糖基转移酶TcCGT1，可以特异性地催化黄酮类、黄酮醇等黄酮类化合物的8-C糖基化黄酮类化合物。Wang等［9]在大豆（Glycine max（Linn）Merr.）毛状根中过表达葛根（Pueraria montana var.lobata）的PIUGT43，发现其编码蛋白酶具有将大豆苷元催化为葛根素的活性，且对异黄酮具有底物专一性。Mashima等［10]将山葵（Wasabia japonica（Miq.）Matsum.）的WjGT1在大肠杆菌中重组表达发现，该酶可将芹菜素或木犀草素催化合成异牡荆苷或异荭草苷。Brazier-Hicks等［11]发现水稻（Oryza sativa L.）OsCGT可通过与脱水酶协同作用催化2-羟基黄酮合成黄酮C-糖苷。在甜荞（Fagopyrum esculentum moench）的研究中发现，糖基转移酶FeCGTa和FeCGTb均以2-OH黄烷酮为底物催化生成黄酮C-糖苷［12]。

苦荞（Fagopyrum tataricum Gaertn）属于蓼科荞麦属，是起源于我国西南地区的一年生小杂粮作物，含有丰富的高活性类黄酮化合物（1.0%-3.0%），具有较高的保健作用［3-4]。目前，在苦荞种子中已鉴定到90余种类黄酮化合物，其中一半以上为黄酮糖苷类化合物，包括类黄酮C-糖苷中的牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素等［3]。在苦荞中，目前已有多个糖基转移酶被功能鉴定催化了黄酮糖苷的合成［13-17]，但未见参与类黄酮C-糖苷生物合成的C-糖苷糖基转移酶基因的相关报道。课题组前期对苦荞糖基转移酶基因家族进行系统鉴定，通过系统进化分析发现候选基因与已鉴定功能的C-糖基转移酶聚在一支（数据未发表）。本研究利用RT-PCR技术，从苦荞品种‘品苦1号’中克隆一个可能参与苦荞类黄酮C-糖苷生物合成的C-糖基转移酶基因FtUGT143，并对其进行生物信息学、系统进化、分子对接、基因表达、基因表达量与类黄酮C-糖苷含量关系分析，以期为苦荞类黄酮C-糖苷生物合成中的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 苦荞品种‘品苦1号’，由山西农业大学提供。

1.1.2 载体 pMD19-T，购自大连宝日医生物公司。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取‘品苦1号’芽苗期的根、茎、叶，6叶期植株的根、茎、叶，成年期植株的花、种子的总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 cDNA（complementary DNA）获取 以叶片的总RNA为模板，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行反转录，用于基因全长CDS序列克隆的第一链cDNA。根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒说明书，分别以‘品苦1号’芽苗期的根、茎、叶，6叶期植株的根、茎、叶，成年植株的花、种子的总RNA为模板，合成用于荧光定量的第一链cDNA。

1.2.3 FtUGT143全长CDS的克隆 根据已知苦荞基因组数据中注释的FtUGT143的核酸序列，BioXM 2.7和DNMAN软件设计扩增目的基因片段全长的CDS序列的特异性引物FtUGT143-F和FtUGT143-R（表1），以1.2.2中叶cDNA为模板，高保真KOD酶进行PCR扩增。PCR产物加A尾反应后，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收、连接目的产物、连接pMD19-T载体、转化大肠杆菌感受态DH5α。PCR检测阳性菌株后，送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 List of primers'sequences in this study

1.2.4 FtUGT143的生物信息学分析 CodonW 1.4.2对FtUGT143基因密码子偏好性参数分析；BioXM 2.7查询其最大开放阅读框（open reading frame, ORF），预测其编码的蛋白序列及编码蛋白的等电点和分子量大小；NCBI中的BLAST比对查找FtUGT143蛋白的同源蛋白，DNAMAN进行蛋白序列多序列比对；MEGA 7.0软件采用NJ法构建FtUGT143与其他已知的植物黄酮糖基转移酶基因构建系统进化树；AutoDock Vina 1.1.2对FtUGT143与4种类黄酮代谢小分子进行分子对接模拟实验，Pymol 2.4.0可视化分析对接结果。

1.2.5 FtUGT143在苦荞不同组织部位中的表达分析 BioXM 2.7软件和DNAMAN软件分析设计FtUGT143的实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR）引物qFtUGT143-F和qFtUGT143-R，设计内参基因FtUPL7的荧光定量引物qFtUPL7-F和qFtUPL7-R（表1），以1.2.1中‘品苦1号’芽苗期的根、茎、叶，6叶期植株的根、茎、叶，成年植株的花、种子的总RNA为模板，苦荞的FtUPL7作为内参基因，SYBR® Premix Ex TaqTMII试剂盒进行荧光定量分析，伯乐bio-rad实时定量PCR仪CFX96扩增，每个样本设置3个生物学重复和3个技术重复。2-ΔΔCt法计算基因的相对表达情况。具体操作参照Li等［18]的方法进行。参照王璐瑗等［19]方法提取和测定各组织部位中总黄酮含量。GraphPad Prism 9.0分析FtUGT143在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间相关性。

2 结果

2.1 FtUGT143全长CDS的克隆及其编码蛋白特征分析

以‘品苦1号’叶片cDNA为模板，基因特异性引物FtUGT143-F和FtUGT143-R扩增出一条约700 bp的目的条带（图1）。目的条带经测序比对，发现其与参照序列完全一致，CDS全长为678 bp，编码226个氨基酸。Protparam在线软件对FtUGT143进行分析，结果显示，相对分子质量为25.16 kD，理论等电点为4.76，是稳定的疏水蛋白。

图1 苦荞FtUGT143基因全长CDS克隆Fig. 1 Full-length CDS clone of the FtUGT143 gene of buckwheat（Fagopyrum tataricum）

2.2 FtUGT143的生物信息学分析

2.2.1 FtUGT143的密码子偏好分析 Codon W分析FtUGT143基因序列的密码子偏好性，其序列的有效密码子数（ENC值：范围20-61）为51.17，表明FtUGT143的密码子偏好性较弱；密码子适应指数（CAI值：范围0-1）为0.1574，进一步表明该基因的密码子偏好性较弱。FtUGT143的GC与GC3s含量均小于50%，该ORF序列中GC含量小于AT含量，说明苦荞的糖基转移酶基因在编码时偏好使用A或T结尾的密码子。对FtUGT143密码子RSCU值分析（图2），其中有26个密码子的RSCU值大于1，是FtUGT143的偏好密码子；有13个密码子的RSCU值大于1.5，为高频率密码子；而AGA和CCG的RSCU值最大（2.67），表明FtUGT143基因对AGA和CCG具有极强的偏好性。

图2 FtUGT143密码子RSCU值分析Fig. 2 Analysis of FtUGT143 codon's RSCU values

2.2.2 FtUGT143同源蛋白的多序列比对系统进化分析 FtUGT143蛋白序列在NCBI数据库进行BLASTp比对搜寻发现，FtUGT143与多种植物的糖基转移酶序列有较高的同源性。蛋白多序列比对发现，FtUGT143的蛋白序列在C-末端结构域附近存在一个由44个氨基酸组成的PSPG box（图3-A）。该PSPG box中包含高度保守的氨基酸序列HCGWNS（图3-B），与前期研究的结论一致。PSPG box区域第44个氨基酸是谷氨酰胺（Gln,Q），推测FtUGT143可能偏好以UDP-葡萄糖作为糖供体，具体情况还需要进一步研究。根据文献和NCBI数据库，获得多种植物已鉴定功能的糖基转移酶，用MEGA7.0软件构建NJ系统进化树。结果（图4）显示，FtUGT143和催化黄酮化合物C位糖基化的糖基转移酶聚在同一分支上且与金莲花TcCGT1亲缘关系最近。

图3 植物UGT蛋白氨基酸的序列多重比对与PSPG box比对分析Fig. 3 Sequence multi-alignment of plant UGT protein amino acids and comparative analysis of PSPG box

图4 FtUGT143系统进化树分析Fig. 4 FtUGT143 phylogenetic tree analysis

2.2.3 FtUGT143蛋白与底物分子对接 SWISSMODEL对FtUGT143进行同源建模并使用AutoDock Vina 1.1.2对FtUGT143与山奈酚、表儿茶素、木犀草素、芹菜素（其中芹菜素和木犀草素是苦荞中主要黄酮C-糖苷的合成底物）进行分子对接分析，结果（表2）表明，FtUGT143的最适底物受体为木犀草素，其次是芹菜素。将FtUGT143的对接结果导入Pymol中进行可视化分析（图5）。FtUGT143与底物木犀草素通过传统氢键与氨基酸残基（Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln123）相互作用；FtUGT143与底物芹菜素通过传统氢键与氨基酸残基（Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln122、Gln123）相互作用，推测以上残基是FtUGT143与小分子相互作用的关键残基，主要作用力为氢键。这说明了FtUGT143可以与木犀草素和芹菜素发生相互作用，推测其可能具有催化木犀草素和芹菜素合成黄酮C-糖苷的功能。

图5 FtUGT143和木犀草素、芹菜素对接示意图Fig. 5 Schematic diagram of FtUGT143 docking with luteolin and apigenin

表2 FtUGT143与4种类黄酮代谢小分子的对接结果Table 2 Docking results of FtUGT143 with four flavonoids metabolizing small molecules

2.2.4 FtUGT143在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析 实时荧光定量PCR检测结果显示，该基因在苦荞芽苗期的叶中表达量最高，其次是芽苗期的茎和根，而在6叶期植株的根、茎、叶和成年期植株的花、种子中表达量相对较低（图6-A）。各组织部位中的4种C-黄酮-牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素相对含量分析结果显示芽苗期植株的叶、茎和根含量相对最高，在其他时期的不同组织部位中含量较低（图6-B）。FtUGT143在不同组织部位中的表达量与4种C-黄酮相对含量间的相关性分析显示，FtUGT143的表达量与牡荆素（R2=0.9614）、异牡荆素（R2=0.9649）、荭草素（R2=0.9714）和异荭草素（R2=0.9630）4种C-黄酮含量间显著正相关（图6-C），表明FtUGT143可能参与这4种C-黄酮的合成。

图6 FtUGT143在苦荞不同组织部位中的表达量与4种C-黄酮含量间的相关性Fig. 6 Correlation between the expressions of FtUGT143 in the different tissue sites of buckwheat and the content of four C-flavonoids

3 讨论

苦荞药食同源，富含高生物活性的黄酮类化合物。黄酮糖苷化合物的生物合成主要由糖基转移酶完成［20]。黄酮C-糖苷是苦荞类黄酮生物合成途径中的次级代谢产物，因此，研究苦荞中C-糖基转移酶基因，对于深入了解苦荞中黄酮C-糖苷的生物合成机制具有重要意义。

3.1 FtUGT143是C-糖基转移酶

本研究通过RT-PCR技术成功克隆到一个可能参与苦荞中黄酮C-糖苷生物合成的糖基转移酶基因FtUGT143，其编码蛋白序列由224个氨基酸残基组成，是一个稳定的疏水蛋白。对FtUGT143的密码子偏好模式进行分析，ENC值为51.17，CAI值为0.1574。FtUGT143的GC与GC3s含量均小于50%。为后续FtUGT143蛋白结构预测与定向突变功能鉴定提供了理论基础。黄酮苷元主要包括芹菜素及其羟基或甲基化产物木犀草素、黄芩素等［5]，其被UGT作为底物催化其糖基化形成黄酮糖苷。例如，水稻［21]的OsUGT706D1和 OsUGT707A2 分别以芹菜素作为底物，在7-O和5-O位置催化形成黄酮糖苷。长春花［22]（Catharanthus roseus（L.）G.Don）的aUGT3以黄芩素作为底物在7-O位置催化形成龙胆糖苷。黄酮C-糖苷主要为牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷和异荭草苷，分别是芹菜素和木犀草素在C-6位或者C-8位在C-糖基转移酶作用下连接一分子的葡萄糖形成的黄酮C-糖苷［23]。目前，C-糖基转移酶在金莲花［8]、葛根［9]、山葵［10]、甜荞［12]等多种植物中被功能鉴定。研究表明糖基转移酶基因家族在C端有44个氨基酸所组成的高度保守PSPG box序列［24]。本研究通过对蛋白氨基酸序列进行多重比对发现，FtUGT143具有相同的保守序列。系统进化树分析表明，FtUGT143与玉米、大豆、水稻、甜荞的C-糖基转移酶聚在一支，表明FtUGT143是糖基转移酶基因家族的C-糖基转移酶成员，这暗示该基因可能具有直接催化黄酮化合物骨架的C位形成黄酮糖苷的功能。

3.2 FtUGT143可能参与苦荞中黄酮C-糖苷生物合成

研究认为当蛋白与底物分子的自由结合能（ΔG）小于-29.288 kJ/mol有强烈的结合能力［6,25]。为了解苦荞FtUGT143在C-黄酮生物合成中可能催化的底物及功能，本研究对FtUGT143蛋白进行同源建模与分子对接模拟，结果显示FtUGT143能与合成C-黄酮糖苷牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素的底物木犀草素（ΔG= -33.8904 kJ/mol）和芹菜素（ΔG=-32.2168 kJ/mol）相互作用，这与课题组前期在苦荞与甜荞的代谢组比对分析中的结论相同［3]，进一步表明FtUGT143可能具有催化苦荞中这4种C-黄酮生物合成的功能。通过Pymol分析后推测FtUGT143受体蛋白与芹菜素相互作用的关键氨基酸残基为Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln123，这些关键残基位于配体与大分子结合的活性口袋中，为后续对FtUGT143的活性位点研究提供了参考价值。

荧光定量表达分析显示，FtUGT143主要在苦荞芽苗期的叶、茎和根中表达，与甜荞中C-黄酮糖基转移酶同源基因FeCGTa和FeCGTb表达模式相似［12]。研究发现在甜荞的体外酶活实验中以2-OH黄烷酮为底物催化生成黄酮C-糖苷［12]。进一步分析显示，FtUGT143在苦荞不同组织部位中的表达量与4种C-黄酮牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素的含量显著正相关。有关FtUGT143在苦荞C-黄酮生物合成中的详细功能还需进一步地研究。

4 结论

苦荞FtUGT143是糖基转移酶基因家族的一员，具有C-糖基转移酶的特征，可能催化苦荞中C-黄酮牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素的生物合成。