盘龙参内生真菌胞内细菌7-2H的分离鉴定和促生特性研究

方澜 黎妍妍 江健伟 成胜 孙正祥 周燚

（1. 长江大学农学院，荆州 434025；2. 湖北省烟草科学研究院，武汉 430000）

盘龙参［Spiranthes sinensis（Pers.）Ames]，又称绶草，隶属于兰科植物绶草属，具有丰富的药用价值，但盘龙参在自然条件下萌发率极低，已被列为国家二级濒危保护植物［1]，其种子细小、无胚乳，需要和适宜的真菌共生才能萌发，因而与真菌有天然的共生关系［2]。裴东方等［3]在研究盘龙参内生真菌多样性时，从根、茎、叶和花序中共分离到48株内生真菌，包含10个属，其中包括附球菌属（Epicoccum）。附球菌是一种普遍存在的子囊菌，一些物种被报道为植物病原体，但通常也以内生的生活方式存在于多种植物中，能够产生许多具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗菌作用的次生代谢产物，具有潜在的应用价值［4]。附球菌属也有一些物种被证明是植物促生菌和多种病原真菌的有效生防菌，Koné等［5]研究发现，从葡萄（Vitis vinifera）植株中分离得到的黑附球菌（E. nigrum），可以抑制水稻稻瘟病并促进水稻（Oryza sativa L.）显著生长。高粱附球菌（E.sorghinum）也已被作为兰科植物内生真菌报道，Jin等［6]在兰科植物铁皮石斛（Dendrobium officinale）内生真菌多样性的研究中，从铁皮石斛根茎内分离得到了E. sorghinum。

真菌内生细菌（endohyphal bacteria, EHB），是一类生活在真菌菌丝或孢子内的细菌。大量研究表明真菌体内普遍存在EHB，已报道的EHB大部分存在于子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）和球囊菌门（Glomeromycota）中［7-11]。EHB在宿主真菌的代谢、繁殖和抗性中起着重要作用［12]。EHB可以帮助宿主真菌固氮［13-14]，促进宿主真菌对底物的高效利用［15]，提高宿主真菌的生长速度并诱导真菌产孢［16-17]，协助真菌促进种子萌发［11]，促进真菌对植物的促生长作用［18-19]。更重要的是，EHB的缺失可能导致宿主真菌培养过程中关键代谢产物的减少甚至消失。Partida-Martinez等［20]发现导致水稻幼苗枯萎病的小孢根霉（Rhizopus microsporus）所产生的根霉菌素，不是自身产生，而是其菌丝内的伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia rhizoxinica）代谢合成的。Ruiz-Herrera等［13]发现玉米黑粉病病原真菌（Ustilago maydis），其在无氮培养基上生长的能力取决于其内生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。Jiang等［21]从白芨（Bletilla striata）根部分离得到的非致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），可以促进白芨的生长并在其体内定植形成菌丝团，Cheng等［19]在后续研究中证明该尖孢镰刀菌体内存在EHB，并发现从菌丝中分离得到的产气克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）的缺失会导致宿主真菌的IAA分泌量减少，进而影响植物的促生长能力。细菌与植物内生真菌之间也存在共生关系。因此，研究EHB的种类、分布、功能以及其对宿主的影响非常重要。EHB可以被分离，在真菌外也能发挥一定的功能，是有待深入挖掘的新微生物资源，值得进一步研究和利用。

课题组前期从盘龙参根部分离出的内生真菌高粱附球菌具有植物促生长能力［22]，本研究从真菌体内分离得到一株内生栖稻根瘤菌（Rhizobium oryzihabitans），并对其促生长特性进行研究，旨在探索真菌菌丝内的细菌特性，以期发掘能够促进植物生长的真菌内生细菌，为后续微生物菌剂研制提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株及其他材料 盘龙参内生真菌高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）由长江大学农学院植物与微生物互作实验室保存。细菌通用探针EUB338（5'-GCTGCCTCC CGTAGGAGT-3'），5'末端用荧光素Cy3（红色）标记；PCR引物、酶及常规试剂均购自擎科生物科技有限公司。抗荧光淬灭封片剂购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 供试试剂 磷酸盐缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，去离子水定容1000 mL，pH值为7.4。杂交缓冲液：400 μL甲酰胺，350 μL DEPC水，250 μL EDTA。洗涤缓冲液：1 mol/L Tris-HCl，10% SDS，5 mol/L NaCl。Salkowski比色液：50 mL 35% HClO4，1 mL 0.5 mol/L FeCl3。

1.1.3 培养基 参照王亚军等［23]方法配制培养基：PDB培养基、LB培养基、NBRIP培养基、MKB培养基、CAS检测培养基。

1.2 方法

1.2.1 真菌内生细菌的检测 采用荧光原位杂交技术（FISH）检测真菌菌丝中是否存在细菌［24]。收集培养5 d的盘龙参内生真菌E. sorghinum的菌丝至1.5 mL的离心管中，加1 mL磷酸盐缓冲液洗涤。8000 r/min离心收集菌丝，加入1 mL 4%（V/V）甲醛溶液4℃固定5-6 h。使用1 mL磷酸盐缓冲液漂洗2次，然后依次用50%、70%、95%（V/V）乙醇进行脱水，每组3 min。加入90 μL杂交缓冲液，混合10 μL EUB338探针（10 μmol/L），46℃水浴1.5 h杂交。随后用1 mL的洗涤缓冲液清洗多余探针，再在洗涤缓冲液中46℃水浴15 min。制片时加入抗荧光淬灭封片剂，在Nikon ECLIPSE Ni-U荧光显微镜系统下进行显微观察。

1.2.2 真菌内生细菌的分离与鉴定

1.2.2.1 内生细菌的分离 参照谭利涛等［25]的方法进行真菌内生细菌的分离，将真菌接种于PDB培养基中，在28℃下180 r/min振荡培养72 h。收集菌丝体，用70%（V/V）乙醇表面消毒2 min，再用无菌水清洗5次，取100 μL第5次冲洗液涂布于LA培养基上，并在30℃下培养过夜，以确定没有细菌污染。用0.5 mL无菌水将表面消毒的菌丝体重悬并使用无菌研钵研磨，随后将100 μL的研磨混合物转接到5 mL LB培养基中，在28℃下150 r/min富集培养4 h；随后涂布于LA培养基上，在28℃下培养并观察细菌菌落，挑取单菌落纯化细菌得到单一菌株。

1.2.2.2 形态学鉴定 将纯化后的内生细菌稀释涂布至LA培养基上，28℃下培养24 h，观察记录菌落形态、颜色等特征。利用扫描电镜观察菌体形态［26]，将内生细菌接种于LB培养基中，28℃，200 r/min培养20 h，8000 r/min离心收集菌体。在2.5%（V/V）戊二醛溶液中固定2-4 h，然后用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）洗涤菌体3次，依次用30%、50%、70%、90%和100%（V/V）乙醇脱水15-20 min，再浸泡在乙酸异戊酯中15 min，接着使用真空冷冻干燥机中处理3 h。干燥后进行喷金处理，最后用扫描电镜（VEGA 3 SBU）进行拍摄观察。

1.2.2.3 生理生化特性测定 内生细菌的生理生化反应测定参照《常见细菌系统鉴定手册》［27]。

1.2.2.4 分子生物学鉴定 将内生细菌转移到LB培养基中，28℃，200 r/min培养24 h，10000 r/min离心收集菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（OMEGA）提取DNA。用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增其16S rDNA区域，PCR反应体系为40 μL：引物各1 μL，DNA模板2 μL，2×Taq PCR StarMix 20 μL，ddH2O 16 μL，PCR扩增程序见表1。PCR产物送至武汉华大基因技术服务有限公司测序。结果序列在NCBI数据库中进行BLAST分析。利用MEGA软件（version 7.0）采用Neighbor-joining法构建系统发育树，确定其分类地位。

表1 PCR扩增程序Table 1 PCR amplification procedure

1.2.3 菌株7-2H的内生性验证 参照Ruiz-Herrera等［13]的方法进行内生性验证，利用细菌特异性引物ChvE-F101（5'-GCTGGTCTTCCTTGTAGTAA-3'）和ChvE-R653（5'-AACGCCTTCTTCTTCTATGA-3'）［28]，对宿主真菌及内生细菌DNA进行PCR扩增，PCR反应体系同1.2.2.4，PCR扩增程序见表1，检测目的条带。

1.2.4 菌株7-2H的植物促生长特性

1.2.4.1 菌株产生长素能力的测定 采用Salkowski比色法对菌株产IAA能力进行定性测定，观察颜色是否变红，以此来判断菌株是否具有产IAA的能力。制作IAA标准曲线，采用分光光度法定量测定菌株的IAA产量［29]。

1.2.4.2 菌株产铁载体能力的测定 将细菌接种到CAS检测平板上，28℃培养5 d，观察菌落周围是否出现橙黄色晕圈，以此来判断菌株有无分泌铁载体能力。采用CAS比色法对菌株产铁载体能力进行定量测定［30]。

1.2.4.3 菌株溶磷能力的测定 将细菌接种到NBRIP无机磷培养基上，28℃培养3 d，观察菌落周围是否有透明圈的形成，以此来判断菌株有无解磷能力。制作可溶性磷的标准曲线，采用钼锑抗比色法对菌株溶磷能力进行定量测定［31]。

1.2.5 菌株7-2H对水稻幼苗的促生作用 选择饱满度良好的水稻种子，使用70%（V/V）乙醇消毒30 s后，2%（V/V）次氯酸钠消毒1 min，无菌水冲洗3次，在细菌菌悬液（OD600= 1.0）中室温静置孵育过夜，以LB培养基浸种为对照（CK）；随后将种子取出用无菌水漂洗2次后，放置于铺有两层无菌湿润滤纸的培养皿中，每皿放20粒种子，置于25℃培养箱中培养，每日向培养皿中加入适量无菌水使滤纸保持湿润。7 d后测量水稻幼苗的茎长、根长、鲜重、干重［32]。每个处理3个重复。

1.2.6 菌株7-2H的全基因组测序 将内生细菌接种于LB培养基中，28℃，200 r/min条件下培养12 h后，10000 r/min离心10 min后收集菌体，液氮速冻后，委托武汉贝纳科技有限公司进行全基因组测序。全基因组测序使用第三代Nanopore测序仪和第二代Illumina Hiseq技术完成。使用unicycler（0.4.8）（https://github.com/ rrwick/ unicycler）组装获得的数据。使用Ezbioclould数据库在线工具ANI Calculator，将组装后的基因组序列与该属其他代表菌株进行平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）比对；通过Prokka软件（1.1.2）预测组装基因组的编码基因，并通过BLAST将预测的基因序列与GO、COG、KEGG、Swiss-Prot、Refseq等功能数据库进行比较，得到基因功能注释结果。

1.2.7 数据分析 利用软件SPSS 19.0对实验数据进行样本间差异显著性分析，使用Graphpad prism 8.0软件作图。

2 结果

2.1 真菌E. sorghinum内生细菌的检测

用编号为EUB338的荧光素标记的细菌单链核酸为探针，与真菌E. sorghinum菌丝中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。在荧光显微镜下观察，发现真菌菌丝通道内存在荧光信号，证实其体内含有细菌（图1）。

图1 荧光原位杂交（FISH）检测E. sorghinum菌丝中的细菌Fig. 1 Detection of bacteria in the mycelia of E. sorghinum by fluorescence in situ hybridization

2.2 菌株7-2H的分离鉴定

2.2.1 形态学鉴定 将涂布后的分离平板放置在28℃恒温培养箱中黑暗培养3 d后，经筛选纯化后得到一株细菌，命名为7-2H，菌株7-2H菌落近圆形、规则、边缘完整，凸起呈乳白色，菌落表面光滑不透明。在扫描电镜观察下，菌体呈短杆状，大小为（0.6-1.0）μm×（0.3-0.5）μm；革兰氏染色呈红色，为阴性菌（图2）。

图2 菌株7-2H的菌落形态特征Fig. 2 Colony morphological characteristics of strain 7-2H

2.2.2 生理生化特性测定 对菌株7-2H的生理生化指标测定结果如表2所示，硝酸盐还原、葡萄糖利用、乳糖利用、甘露醇利用、接触酶测定等表现一致，均为阳性；淀粉水解、纤维素降解、蛋白降解、几丁质降解及甲基红试验结果均为阴性。另外，菌株7-2H对卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、红霉素均具有一定的抗性，当卡那霉素和庆大霉素浓度达到200 μg/mL时，菌株长势良好，生长未受到抑制，当氯霉素浓度达到100 μg/mL时不能生长，当红霉素浓度达到200 μg/mL时才不能生长，但对四环素抗性不高，当浓度达到25 μg/mL时已经不能生长。

表2 7-2H 的各项生理生化测定Table 2 Physiological and biochemical determination of 7-2H

2.2.3 分子鉴定 菌株7-2H的16S rDNA基因测序结果在NCBI上进行BLAST比对，7-2H与根瘤菌（Rhizobium sp.）（MN662624）同源性为100%。在MEGA 7.0中构建系统发育树，结果如图3所示，菌株7-2H（GenBank登录号：OQ165181）与模式菌株Rhizobium oryzihabitans M15（MT023790）同源性最高，达96%。因此，结合形态学将菌株7-2H初步鉴定为栖稻根瘤菌（R. oryzihabitans）。

图3 基于16S rDNA序列构建的菌株7-2H系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of strain 7-2H based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株7-2H的内生性验证

用ChvE基因特异性引物扩增真菌E. sorghinum和内生细菌7-2H的DNA，结果（图4）显示，两菌株均能扩出目的条带，其中细菌扩增条带更亮，结果表明真菌基因组DNA混有细菌DNA，但真菌体内的细菌含量相对较少，可证实本文从真菌E.sorghinum菌丝内分离到细菌7-2H。

图4 菌株7-2H基于特异性引物的内生验证Fig. 4 Endogenous verification of strain 7-2H based on specific primers

2.4 菌株7-2H的植物促生长特性

菌株7-2H可使反应液变红，说明其具有分泌IAA的能力，且在培养至第7天的时候产量到达最高，为93.59 mg/L（图5）。菌株7-2H在CAS检测平板上28℃培养5 d，菌落周围有橙色晕圈的存在，表明细菌7-2H具有产生铁载体的能力，产嗜铁素相对含量可达82.18%（图6）。另外，菌株7-2H在NBRIP无机磷平板上28℃培养3 d，菌落周围出现了明显的透明圈，说明该菌株具有溶解无机磷的能力，溶解磷酸盐浓度在第5天高达78.82 mg/L（图7）。

图5 菌株7-2H的产IAA能力测定Fig. 5 Determination of IAA-producing ability of strain 7-2H

图6 菌株7-2H的产铁载体能力测定Fig. 6 Determination of siderophore-producing ability of strain 7-2H

图7 菌株7-2H的溶磷能力测定Fig. 7 Determination of phosphate-solubilizing ability of strain 7-2H

2.5 菌株7-2H对水稻幼苗的促生作用

与LB培养基浸种处理的水稻种子相比，内生细菌7-2H菌液对水稻种子发芽的影响并不显著，但菌液浸种处理过的水稻幼苗的茎长和根长［（5.81±0.35）cm和（6.03±2.05）cm]，显著高于对照组［（4.39±0.07）cm和（2.42±0.42）cm]（P＜0.01），菌株7-2H可明显促进水稻幼苗根系的发育和生长，同时水稻幼苗的鲜重及干重较对照组也显著提高了24.58%、13.39%（P＜0.05）（图8）。

图8 菌株7-2H对水稻种子幼苗生长指标的影响Fig. 8 Effects of strain 7-2H on the growth indexes of rice seed seedlings

2.6 菌株7-2H的全基因组测序

基因组组装后，内生细菌7-2H共获得5个Contig，一条长度为3160 563 bp的环状染色体、一条长度为1932 543 bp的线性染色体和3条长度分别为225389 bp、128416 bp、34944 bp的环状质粒，其GC含量分别为59.29%、59.74%、59.44%、58.20%、61.18%。通过Prokka注释发现，该基因组含有5301个基因，其中编码基因5167个，RNA基因70个（包括57个tRNA基因，12个rRNA基因和1个tmRNA基因）。基于基因组相似性计算，菌株7-2H与标准菌株Rhizobium oryzihabitans M15的ANI值为96.98%，大于物种划分与物种聚类的标准（ANI值为95%），同时与其余菌株之间的ANI值均小于90%，因此，菌株7-2H被鉴定为栖稻根瘤菌（R. oryzihabitans）。

利用预测得到的基因组信息，将环状染色体绘制成基因组圈图，GenBank登录号为CP115806（图9）。其中，基因组功能注释结果见表3，GO注释信息经简化后得到GOslim分类，结果如图10所示，其中与生物学过程相关的基因有1097个，主要涉及跨膜运输、转录调控和糖转运过程。与细胞组分相关的基因有2526个，主要与膜的组成部分、细胞质、质膜的形成有关。参与分子功能相关的基因有2281个，主要参与ATP、DNA和金属离子结合方面。基于KEGG注释结果发现，菌株7-2H基因组中存在色氨酸合成酶trpA、trpB（EC 4.2.1.20）以及吲哚-3-甘油磷酸合酶trpC（EC 4.1.1.48），还含有与铁载体合成相关的基因entC（EC 5.4.4.2）、entB（EC 3.3.2.1）、entE（EC 2.7.7.58）、entA（EC 1.3.1.28），通过注释结果还发现，菌株7-2H存在磷酸盐特殊转运系统（pstS、pstC、pstA、pstB和phoU）。

图9 菌株7-2H的基因组圈图Fig. 9 Genome circle of strain 7-2H

图10 菌株7-2H基因组GO功能注释Fig. 10 GO functional annotation on the genome of strain 7-2H

表3 菌株7-2H基因功能注释数据库分布情况Table 3 Database distribution of gene functional annotation from the strain 7-2H

3 讨论

3.1 真菌内生根瘤菌的相关报道

根瘤菌（Rhizobium sp.）是一类革兰氏阴性菌，目前根瘤菌大多属于α-和β-变形菌纲，共17个属，近100多个种［33]，一般来说，大部分根瘤菌都是从豆科植物根瘤中分离得到的，然而一些自由生活的根瘤菌也经常从土壤、水体和植物根系中分离［34]，栖稻根瘤菌（R. oryzihabitans）由Zhao等［35]从水稻根部分离得到，基于与现有根瘤菌之间的遗传和表型的明显差异，将其定义为新种并命名。根瘤菌作为真菌内生细菌早有报道，Agnolucci等［36]在分析研究斗管囊霉属［Funneliformis（F. coronatum、F. mosseae）]以及根内根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）的细菌群落的多样性中均发现了根瘤菌的存在，但并未将真菌内生细菌分离出来。Shaffer等［37]在研究栖息于热带种子和叶片的真菌内生细菌的多样性、特异性和系统发育关系时，在微壳色单隔孢属（Microdiplodia）也发现了根瘤菌的存在。Sharma等［38]从菌根真菌印度梨形胞（Piriformospora indica）中分离得到的真菌内生放射根瘤菌（R.radiobacter）具有产IAA的能力，可以有效促进植物生长，并且能够激发植物抗病性，Guo等［39]在后续研究中发现该放射根瘤菌还有助于真菌及植物共生关系的建立。本文成功从盘龙参内生真菌E.sorghinum菌丝中分离到一株内生栖稻根瘤菌，这是R. oryzihabitans作为真菌内生细菌的首次报道，同时本研究发现R. oryzihabitans 7-2H具有较强的植物促生长能力。

3.2 根瘤菌对非豆科植物的促生作用

根瘤菌不仅可以与豆科植物共生结瘤固氮，也可以对水稻、玉米（Zea mays L.）、小麦（Triticum aestivum L.）和油菜（Brassica napus L.）等非豆科植物产生有益影响［34]，通过固氮、溶磷、解钾、产IAA、铁载体和ACC脱氨酶等功能，帮助植物充分吸收利用所需营养物质，促进植物生长［40]。Saghafi等［41]研究表明，具有产ACC脱氨酶能力的耐盐大豆根瘤菌（Sinorhizobium mellilote）和豆科根瘤菌（R. legominozaroum）可以提高油菜的根茎生长、干重、叶片数和相对含水量；Chaudhary等［42]从绿豆（Vigna radiata）根部分离的内生细菌R. pusense能显著产生IAA、铁载体、ACC脱氨酶，并能有效溶磷，同时显著增加绿豆植株鲜重和干重。Zhao等［35]从水稻根部分离得到的栖稻根瘤菌（R. oryzihabitans）具有产生IAA、铁载体、ACC脱氨酶和促进水稻生长的能力。本研究中分离得到的真菌内生细菌R.oryzihabitans 7-2H同样具有产IAA、铁载体和溶磷的能力，可以显著促进水稻幼苗的根茎生长，全基因组测序结果也确定了与产IAA、铁载体和溶磷相关基因，具有较强的植物促生潜力。

3.3 真菌内生细菌对宿主真菌的重要作用

真菌内生细菌（EHB）对宿主真菌的孢子萌发、菌丝生长、物质代谢、抗逆性、生物胁迫等诸多方面都存在影响［7,10,16-17,20,43]，松茸（Tricholoma matsutake）的EHB群落被证明是促进其菌丝生长和生物量增加的重要因素［44]，双孢蘑菇（Agaricus bisporus）的EHB群落表现出生物防治潜力［7]。因此，在一定程度上，EHB都会对宿主真菌的生长发育起到一定的辅助作用，而且越来越多的研究结果表明，EHB不仅能协助宿主真菌，还有助于真菌共生植物的生长发育［39]，Cheng等［19]通过抗生素继代培养将EHB产气克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）从尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中去除后，其产IAA的能力显著下降，但将EHB回导至宿主真菌体内后，真菌产IAA的能力有所恢复，研究结果表明EHB增强了宿主真菌产IAA的能力，从而影响真菌促进植物生长的能力。本研究仅分离出一株与宿主真菌同样具有一定促生效果的内生细菌，但该菌与宿主真菌之间的功能联系仍不清楚，需进一步研究。

4 结论

本研究从盘龙参内生真菌高粱附球菌（E. sorghinum）菌丝内分离得到一株内生栖稻根瘤菌（R. oryzihabitans），该细菌具有较强的产IAA、铁载体和溶磷的能力，可显著提高水稻幼苗的茎长、根长、鲜重和干重，拥有良好的促进植物生长能力，可作为后续研发微生物菌肥的菌种资源。