两种砧木楸树嫁接苗生长差异及转录组比较分析

付钰 贾瑞瑞 何荷 王良桂 杨秀莲

（南京林业大学风景园林学院，南京 210037）

楸树（Catalpa bungei C.A.Meyer.），属紫葳科梓树属落叶乔木，是我国特有的优质用材树种和观赏树种［1-3]。楸树树形优美、花大色艳，极具观赏价值，其材质优良，素有“木王”美誉［4-5]。我国造林、园林绿化、道路工程等对楸树资源的需求量与日俱增，但因楸树自花不育，出苗率低等特点，使幼苗繁殖困难，严重阻碍了楸树的发展，进而导致楸树资源日益萎缩［6-7]。因此，实现楸树的良种扩繁是缓解国内资源供需矛盾的关键一环。

嫁接，是将幼苗的枝条或茎（接穗）连接到另一种植物（砧木）的合适部分，彼此协调，形成完整的植株［8-9]。嫁接对于植株的生长具有显著的促进作用。在西瓜砧木种质潜力的研究中发现，所有嫁接植株相比于未嫁接植株在叶子数量、根干重等生长参数上都表现出优越的性能［10]。正因如此，嫁接逐步成为园艺植物营养繁殖和性状改良的常见做法以及大规模繁殖的主要途径［11-12]。在高等植物嫁接过程中，接穗和砧木之间会发生一些遗传物质的长距离运输来参与植株代谢调控［13]。随着研究水平的不断提高，嫁接过程中分子领域的探索也逐步深入。

转录组，即生物体的全部转录物集合，而转录组学是指在RNA水平上对基因表达的研究［14]。对于植物来说，其生长发育及其形态都会受到相关基因的严格控制［15]。在转录组研究中发现,嫁接可以影响相关基因的表达，进而调节整个植株的生命活动［16]。嫁接柿的转录组研究中发现，中间砧‘南通小方柿’通过影响茎生长发育相关代谢通路中基因表达量的变化进而起到矮化作用［17]；嫁接苹果的根系生长发育转录组研究中，证实了接穗特性可以通过对糖代谢和生长素等信号通路的调节来影响砧木表型［18]；另外，在不同柑橘砧木组合的转录组分析中发现，不同砧木显著影响嫁接植物中生长素和赤霉素信号途径相关基因的表达进而影响生长［15]。虽然很多木本植物在嫁接领域中关于转录组的研究不断深入，但是对于不同砧木楸树嫁接苗之间生长发育差异的分子机制仍不清楚。

以往的研究中，对于楸树嫁接苗的生长，更多的是集中于形态和生理层面上的探索。为进一步了解不同砧木楸树嫁接苗生长差异的分子机制，选取楸树良种‘苏楸1号’作为接穗，以梓树和滇楸为砧木，在形态和生理学研究基础上，进一步对两种嫁接组合苗进行转录组测序分析，从转录水平上筛选不同砧穗组合嫁接苗生长发育的差异基因。研究结果可为进一步阐明楸树梓砧和滇砧嫁接苗生长差异机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试接穗为楸树良种‘苏楸1号’，砧木为1年生梓树和滇楸的实生苗，砧木粗度约为1 cm，长度约为18 cm。试验所用砧木和接穗均来自南京林业大学白马科研基地楸树资源圃。嫁接试验于2020年4月中旬进行，采用单芽接，两个组合分别嫁接200株，嫁接苗按0.6 m×1.5 m的株间距种植。文中梓砧嫁接组合和滇砧嫁接组合分别简写为ZS和DS。于2021年8月上旬取ZS和DS相同部位的顶芽和由上至下第5片大小基本一致的叶片，每组合取4株嫁接苗，做好标记立即放入液氮速冻，之后置于-80℃超低温冰箱保存用于转录组测序。

1.2 方法

1.2.1 生长相关指标测定 嫁接苗生长6个月后，统计两个嫁接组合的成活率（成活率=成活株数/嫁接总数量×100%）。于当年12月初，各嫁接组合随机选择30株，用游标卡尺测定新梢基部5 cm处的直径，为新梢当年粗度。用卷尺测定嫁接部位到新梢顶端的长度，为新梢当年长度。于2021年4月中旬，同样方法测定嫁接部位上下粗度（即接穗/砧木粗度比）。

1.2.2 RNA提取和文库构建 用液氮研磨提取ZS、DS的顶芽和叶片的RNA，每组合的叶片和顶芽各有3个生物学重复，共计12个样品（表1）。使用从美国Invitrogen公司购买的Plant RNA Purification Reagent试剂盒提取RNA。将具有polyA尾巴的真核mRNA用带有Oligo（dT）的磁珠富集，以用超声波片段化后的mRNA为模板，在逆转录酶体系中以随机寡核苷酸为引物将其逆转录成cDNA第一条链，将RNA链降解后，合成cDNA第二条链。将双链cDNA经纯化后进行末端修复，加入A尾，链接测序接头，扩增连接产物并纯化，最终获得cDNA文库。

表1 嫁接组合及取样部位Table1 Grafting combination and sampling part

1.2.3 测序数据处理 cDNA文库质检合格后，使用Illumina HiSeq2500平台对其进行测序。为保证测序得到的原始数据的质量，减少干扰，对Raw reads进行质控。进一步采用一定的标准低质数据进行过滤，包括去除含Adapter、含N比例大于10%、全部都是A碱基以及低质量的Reads。

1.2.4 差异表达基因分析 使用DESeq2软件对ZS和DS嫁接组合叶片和顶芽中的基因表达水平进行分析，得到Reads count数据，并将Reads count数据标准化，进而得到FDR值，筛选FDR＜0.05且|log2FC|＞1的显著差异基因。差异表达基因的GO富集分析由GOseq R软件进行［19]，KEGG富集分析由KOBASs软件进行［20]。

1.2.5 RT-qPCR验证 将转录组测序后返回样本的DS和ZS的叶片总RNA反转录成cDNA，反转录试剂盒采用北京全式金生物技术有限公司的TransScript One-Step试剂盒，严格按照试剂盒内说明书进行操作，反转录得到的cDNA稀释10倍后置于-20℃冰箱保存。在与光合作用、营养物质转化相关通路以及相关基因功能预测中，挑选出4个FPKM值高于10的差异表达基因作为验证基因，利用NCBI Primer-BLAST和Primer Quest设计上述差异表达基因的特异性引物。选择CfMADH为内参基因用于分析基因的表达［21]。将设计好的引物序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2）。使用TaKaRa的TB Green® Premix Ex Taq试剂盒配置好混合液后，在StepOne PlusTM Real-Time PCR Instrument上进行RT-qPCR，按以下程序进行：95℃，30 s；40个循环（95℃，45 s；60℃，30 s；95℃，15 s）。荧光定量数据采用2-ΔΔCT相对定量计算。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.6 统计分析 生长相关指标数据利用SPSS 26.0软件采用样本独立t检验法对两个楸树嫁接组合间的差异显著检验（P＜0.05）。柱状图使用Microsoft Excel 2010绘图。

2 结果

2.1 两种嫁接苗的生长状况

ZS和DS的嫁接成活率和各生长量之间存在显著性差异。ZS的成活率为60.95%,约为DS（32.05%）的1.9倍（表3）；ZS的新梢长度、粗度以及接穗粗度/砧木粗度分别为107.51 cm、2.47 cm、0.822，同样显著高于DS（表3）；ZS的叶面积是DS的1.37倍（表3）。

表3 两个楸树嫁接苗的成活率和生长量Table 3 Survival rates and growths of grafted seedlings of two Catalpa trees

2.2 测序数据及质量情况

从表4可以看出，本试验12个样品高质量数据碱基总数为75612 886298 bp，有效数据质量高于20的碱基比例（Q20）均高于96%，最大达到97.36%，有效数据质量高于30的碱基比例（Q30）在91.16%-92.69%之间。过滤后得到的高质量数据中含有N碱基的数据比例为0，过滤后的序列碱基GC比例在43.79%-44.57%之间。

表4 12个样本测序数据的汇总结果Table 4 Summary results of sequencing data for 12 samples

同一嫁接组合相同取样部位的3个重复样本间的皮尔逊相关系数基本均大于0.8，同时组内样本的皮尔逊相关系数均比组间样本的皮尔逊相关系数高（图1），结果表明测序样本的数据可靠、生物学重复性较好，测序数据和序列组装的质量可以进行转录组学分析。

图1 样本间基因表达水平相关性热图Fig. 1 Correlation heat map of gene expression levels among samples

2.3 差异表达基因GO、KEGG分析

差异表达基因的分析主要是针对这两个嫁接组合之间的研究，包括ZS-L与DS-L、ZS-B与DS-B。由火山图可知（图2），越靠近两端的基因，差异越大；对显著水平和差异倍数进行评估，得出比较组之间差异基因的整体分布判断标准为FDR＜0.05，且|log2FC|＞1。总体而言，两嫁接组合叶片间的差异基因数量大于顶芽。ZS-L与DS-L中，差异基因共有372个，其中，上调基因为90个，下调基因为282，差异基因多表现为下调表达，占总差异基因的75.81%。ZS-B与DS-B中，差异基因共有187个，其中，102个基因表现为上调，85个基因表现为下调，差异基因主要为上调，占总差异基因的54.55%。

图2 不同嫁接组合差异基因火山图Fig. 2 Volcano plot of different genes in different grafting combinations

2.3.1 GO分析 在ZS-L与DS-L中，GO分析表明，有22个途径显著富集生物学分类过程，其中，细胞过程、代谢过程和单一生物体过程、刺激反应、生物调节差异表达基因数量较多；有13个途径显著富集在细胞组分分类过程中，其中，细胞、细胞组分、细胞器差异表达基因数量较多；在分子功能分类过程中有11个显著富集途径，结合和催化活性差异表达基因数量较多（图3-A）。在ZS-B与DS-B中，GO分析表明，在生物学分类过程显著富集22个途径，差异表达基因数量较多的为细胞过程、代谢过程和单一生物体过程、刺激反应、生物调节；在细胞组分分类过程显著富集14个途径，细胞、细胞组分、膜、膜组分差异表达基因数量较多；在分子功能分类过程显著富集12个途径，差异表达基因数量较多的为催化活性、结合和转运活性（图3-B）。

图3 不同嫁接组合差异基因的GO注释富集分析图Fig. 3 GO annotation enrichment analysis diagram of differential genes in different grafting combinations

2.3.2 KEGG分析 ZS-L与DS-L中，共有213个显著基因富集到66条代谢途径，其中前20条显著富集通路如图4-A所示，代谢途径、淀粉和蔗糖代谢、次级代谢产物的生物合成、苯丙烷生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、单萜生物合成、类胡萝卜素生物合成、卟啉与叶绿素代谢为主要富集通路。ZS-B与DS-B中，共有137个基因显著富集到45条代谢途径，其中前20条显著富集通路如图4-B所示，ZS-B与DS-B组合差异基因主要显著富集通路有昼夜节律、次级代谢产物的生物合成、碳代谢、玉米素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、过氧化物酶体、卟啉和叶绿素代谢、光合生物的固碳作用。

图4 不同嫁接组合显著差异基因KEGG富集分析图Fig. 4 KEGG annotation enrichment analysis diagram of differential genes in different grafting combinations

2.4 嫁接生长相关代谢通路筛选

针对ZS生长指标显著优于DS，参考嫁接柑橘的相关生长代谢研究［22]，对ZS和DS叶片与顶芽的转录组数据进行比较分析，初步筛选与嫁接生长相关的代谢通路。结果表明叶片与顶芽内参与调控嫁接过程的通路存在差异，在ZS和DS的叶片中筛选得到关键通路有类胡萝卜素生物合成、淀粉和蔗糖代谢和卟啉与叶绿素代谢；在ZS和DS间的顶芽中筛选得到的关键通路有硫胺素代谢、玉米素生物合成、苯并噁嗪类生物合成和淀粉和蔗糖代谢。其中，光合相关代谢通路和淀粉和蔗糖代谢通路在调控嫁接植株生长发育过程中发挥显著作用［15,23]。本研究中，光合相关代谢通路的关键调控途径如图5，淀粉和蔗糖代谢通路的关键调控途径如图6。

图5 光合相关代谢通路Fig. 5 Photosynthesis-related metabolic pathway

图6 淀粉和蔗糖代谢相关通路Fig. 6 Pathways related to starch and sucrose metabolism

2.5 与光合作用相关的差异表达基因

在ZS和DS的叶片中，从光合作用相关的卟啉与叶绿素代谢和类胡萝卜素生物合成通路里共筛选了8个显著差异表达基因（表5）。与ZS相比，DS内这8个差异表达基因均显著下调。卟啉与叶绿素代谢通路中的Unigene0054531（HEMA1）、Unigene0017692（CRD1）、Unigene0005359（CAO）和Unigene0040270（CAO）分别与控制叶片合成乙酰丙酸、二乙烯基原叶绿素内酯和叶绿素b的能力相关。而在类胡萝卜素生物合成通路中的Unigene0051519（PSY1）、Unigene0046587（LCY1）、Unigene0013377（NCED2）、Unigene0044139（CYP707A2）分别参与叶片内番茄红素、胡萝卜素、黄质醛和菜豆酸的合成。

表5 与光合作用相关的差异表达基因统计Tab.5 Statistics of differentially expressed genes related to photosynthesis

2.6 与淀粉和蔗糖代谢相关差异表达基因

不同砧穗组合的叶片和顶芽中的差异表达基因均显著富集于淀粉和蔗糖代谢通路中。共计筛选10个差异表达基因，其中7个在叶片中，4个在顶芽内（表6）。相较于ZS，DS嫁接苗叶片中的Unigene0048299（INV*DC4）、Unigene0038167（SPS2）、Unigene0006320（WAXY）、Unigene0017971（TPPJ）均下调表达，使得蔗糖、淀粉合成受阻；而Unigene0000390（GLU3）、Unigene0022047（GLU1）则表达显著上调，进而促进纤维素大量分解。在顶芽中，Unigene0022047（GLU1）、Unigene0043824（BACOVA-02659）表达显著上调。同时还筛选得到关键基因Unigene0048994（STP-1）和Unigene0047773（BAM1），相比于ZS，DS嫁接苗的顶芽中STP-1的表达量高而BAM1的表达量低，进而导致淀粉糖原转化生成葡糖的途径被阻碍，顶芽生长发育所需的D型葡萄糖合成被促进。

表6 与淀粉和蔗糖代谢相关的差异表达基因统计Tab.6 Statistics of differentially expressed genes related to starch and sucrose metabolism

2.7 差异表达基因验证

根据上述转录组的分析结果，发现在ZS-L和DS-L之间差异更为显著。因此分别从卟啉与叶绿素代谢、淀粉和蔗糖代谢两个通路中挑选出Unigene0040270（CAO）和Unigene0006320（WAXY），以及根据基因功能预测挑选出同光合作用、叶绿素合成相关的Unigene0036149（RCA1）和Unigene0007805（GGAT2），共计4个差异表达基因进行RT-qPCR验证。验证结果与转录组结果中基因的表达变化趋势一致（图7），DS中4个基因表达量均显著低于ZS。

图7 四个基因在两个嫁接组合中的相对表达量Fig. 7 Relative expressions of four genes in two grafting combinations

3 讨论

嫁接可以促进植物的生长发育，根据现有研究可知，通过嫁接成活率、嫁接苗生长状况等方面可以对嫁接苗生长差异进行初步判断。本研究中，梓树为砧木的嫁接苗成活率显著大于滇砧嫁接苗，滇砧苗的成活率仅为32.05%。原因可能与接穗的品种有关，同一接穗品种与不同砧木之间的亲和性有差异，会影响嫁接成活率，这与黑核桃嫁接结果一致［24]。有研究认为，嫁接口上下径的粗度比在一定程度上可以判断嫁接砧穗的亲和性，新梢和砧木粗度比值大于0.8且越接近1，亲和性越高［25]。本研究结果显示梓砧苗的砧穗比显著大于滇砧苗，且比值更接近于1，说明其亲和性更好。

砧木负责嫁接植物的矿物质营养吸收，不同的砧木可能导致嫁接植物生长量的差异［26]。本研究中，梓砧苗的新梢长度、粗度均显著大于滇砧苗，说明两种砧木对楸树嫁接苗的生长量也是有影响的，该结果与芒果嫁接一致［27]。对于梓砧苗更为优越的生长参数，可能是因为梓树早期根系数量和生长量较大，吸收水分和矿质营养的能力更强，从而促进了新梢的生长。

叶片是植物体的光合引擎，光合速率的增强可以通过叶面积增大和叶片数增多实现，进一步促使植株干物质累积量升高，因此叶面积在某种条件下可以反映嫁接苗的发育情况［28]。本研究中，梓砧苗的叶面积显著大于滇砧苗，说明适宜的砧木可通过增大叶面积促进植株生长，西瓜嫁接苗叶片研究也证实了此说法［29]。

同一品种接穗嫁接不同砧木，嫁接苗的表型、生长状况甚至基因表达都会有所改变［30]。本研究对两个嫁接组合的叶片和顶芽进行转录组测序，试图从分子层面分析造成这种生长差异的原因。结果发现在ZS与DS叶片内筛选得到的关键通路主要与光合作用相关，顶芽内筛选得到的关键通路主要与植株的抗逆性和生长分化相关［31-32]，而与碳水化合物相关的淀粉和蔗糖代谢通路在叶片和顶芽内均发挥重要作用，这也表明嫁接亲和组合能够通过增强光合相关的差异表达基因的表达以及碳水化合物代谢来提高细胞增殖能力，从而促进嫁接苗的生长，与黄瓜（Cucumis sativus）嫁接亲和性的研究结果相似［33]。

相关代谢通路中基因的差异表达可能是ZS与DS之间生长差异的原因。在筛选得到的与光合作用密切相关的类胡萝卜素生物合成中发现，编码类胡萝卜素合成途径的第一个限制酶八氢番茄红素合成酶的基因PSY1和编码番茄红素环化酶的LCY1在嫁接组合ZS中的表达量显著高于DS。Kim等［34]认为LCY基因的过表达能够提高ABA含量，以及促进PSY基因的表达进而提高类胡萝卜素的含量，增强植株的抗逆性。在课题组同期生理指标测定结果中，ZS嫁接苗叶片内源ABA的含量更高，可以推测ZS能够通过提高LCY1和PSY1基因的表达，提高叶片内源ABA的含量，增强植株的抗逆性。同样，在另一条光合相关的卟啉与叶绿素代谢通路中，相比于DS，ZS嫁接苗叶片内叶绿素合成关键酶基因CRD1和CAO基因表达量均更高，同期的生理指标测定结果显示，ZS嫁接苗叶片内叶绿素a、b含量及净光合速率、蒸腾速率等指标均显著优于DS。因此，可以推测ZS能够通过提高CRD1和CAO基因的表达，提高叶绿素的合成，促进其积累，从而增强其叶片的光合作用，进而促进植株的生长。

本研究结果表明，淀粉和蔗糖代谢在楸树嫁接苗生长过程中发挥重要作用。在ZS嫁接苗的叶片组织中，淀粉和蔗糖代谢通路内的差异表达基因大多高表达，包括SPS2、SS2、TPPJ和WAXY，这意味着该组合叶片中的淀粉和蔗糖代谢更为活跃，与同期生理指标测定结果显示的ZS叶片的可溶性糖和淀粉含量均大于DS的结果一致，且与柑橘、甘蔗蔗糖结果一致［35-36]。同时，在DS嫁接苗叶片中，编码内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的基因的GLU3和GLU1均高表达，且在其顶芽组织中同样发现GLU1基因表达量较高，而纤维素的分解与内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶密切相关，可以推测DS嫁接苗内的纤维素被大量消耗。已有研究表明，纤维素是构成植物细胞壁的主要成分之一［37]，对维持植物细胞的形态和稳态具有突出的作用。据此，可以进一步推测，GLU3和GLU1的高表达导致DS组织内的纤维素被大量分解，是阻碍嫁接苗的正常生长的原因之一。

4 结论

研究发现梓砧苗的各生长参数均优于滇砧苗，转录组学分析表明光合相关通路及淀粉和蔗糖代谢通路的相关基因在ZS中高度表达，筛选出的差异表达基因可能促进ZS嫁接苗的生长发育。