酿酒葡萄铁调节转运蛋白基因VvIRT1的克隆、表达与功能

宋志忠 徐维华 肖慧琳 唐美玲， 陈景辉 管雪强 刘万好1，，

（1. 鲁东大学农林工程研究院 山东省高校作物高产抗逆分子模块育种重点实验室，烟台 264025；2. 山东省烟台市农业科学研究院，烟台265500；3. 山东省酿酒葡萄与葡萄酒技术创新中心 中粮长城葡萄酒（蓬莱）有限公司，烟台 264000；4. 剑桥大学植物系，英国剑桥 CB23EA）

铁（Fe）是植物细胞中含量较为丰富的矿物元素之一，参与植物光合作用、呼吸作用、激素合成、能量代谢和DNA修复等多种代谢途径和生命过程［1-4]。土壤中的铁多为Fe3+，植物难以直接吸收和利用，特别是石灰性土壤缺铁现象更为明显，土壤缺铁造成作物严重减产或品质降低［5-9]。

Romheld等［10]最早提出了高等植物为适应缺铁胁迫而进化出的两种根际铁吸收机制：吸收机制制I，即通过定位于根细胞膜表面的H-ATP酶向根际分泌H+，降周围土壤pH，促进Fe3+的溶解，并通过铁还原酶（ferric reduction oxidase, FRO）将根系周围的Fe3+被还原为Fe2+，再通过铁调节转运蛋白（iron-regulated transporter, IRT）进入根系被植物吸收利用，常见于双子叶植物和非禾本科单子叶植物［5-6,9-10]；吸收机制II，即通过一系列的酶促反应合成和分泌麦根酸类物质，与根际的Fe3+形成螯合物，由一类专一的铁载体（phytosiderophore, PS）吸收途径被根系吸收利用，多见于禾本科植物［5-6,9-11]。

特别地，铁调节转运蛋白IRT在机制I植物根系转运Fe2+的过程中发挥重要作用，并能调控Fe3+、Mn2+、Cd2+和Zn2+等金属离子的转运，有关植物IRT的生物学功能研究主要集中在拟南芥、水稻等模式植物中［12-17]。Eide等［14]最早从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆了在根部外皮层中高量表达的AtIRT1，该基因敲除后，拟南芥植株的生长严重受阻，并在缺铁土壤中很快死亡［15]。酵母异源表达试验表明AtIRT1具有广泛的底物特异性，可高效转运Fe2+、Mn2+、Cd2+和Zn2+离子［14,16]。拟南芥AtIRT2在根表皮中高量表达并受缺铁胁迫诱导而显著增加，AtIRT2定位于细胞间囊泡中，通过区室化储存Fe2+，以防止由AtIRT1吸收过多的Fe2+而造成毒害［17]。水稻（Oryza sativa）是特殊的机制II植物，不能将Fe3+还原成Fe2+，但能直接吸收利用Fe2+。水稻OsIRT1和OsIRT2均定位在根表皮细胞质膜，具有类似机制I植物IRT转运Fe2+和Cd2+的功能［11-12]。因此，水稻根据其吸收铁的方式同时存在吸收机制I和吸收机制II［5-6,9-12]。

近年来，IRT1同源蛋白陆续在番茄（Solanum lycopersicum）［18]、小金海棠（Malus xiaojinensis）［19]、萝卜（Raphanus sativus）［20]、杜梨（Pyrus betulaefolia）［21]等园艺植物中被鉴定，但其生物学功能尚不清楚。

葡萄（Vitis vinifera L.）基因组序列已公布［22]，然而，葡萄IRT的生物学功能依然未知。酿酒葡萄（V. vinifera L.）是一种全球重要的主要用于酿造葡萄酒的果树，本研究从酿酒葡萄‘马瑟兰’（V. vinifera cv. Marselan）中克隆并鉴定VvIRT1，明确其在酿酒葡萄不同组织部位的特异性表达模式及其对缺铁和高铁毒害的响应，为研究果树铁素吸收与高效利用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为山东省烟台市农业科学研究院葡萄资源圃中的5年生‘马瑟兰’成年树和组培幼苗［23]，酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）fet3fet4和表达载体pYH23为鲁东大学农林工程研究院实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 胁迫处理 利用‘马瑟兰’组培幼苗，以1/2 MS液体培养基为对照，参照张璐等［23]、Song等［24]和崔吉洁等［25]方法进行缺铁（0 mmol/L）和高铁毒害（500 μmol/L FeNa-EDTA）处理，3次生物学重复，每次处理12棵幼苗。

1.2.2 VvIRT1的克隆 以拟南芥AtIRT1（AT4G-19690）的氨基酸序列为参考序列［14,16]，在葡萄基因组数据库［22]中检索可能的VvIRT1同源蛋白。将其结果经Pfam（http://pfam.xfam.org/search）在线服务器预测功能结构域。

从葡萄基因组数据库获得VvIRT1的CDS序列（coding sequence），设计上下游引物，提取‘马瑟兰’组培幼苗整株的总RNA，通过PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒（TaKaRa，大连，中国）合成第一链cDNA为模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大连，中国）扩增目的基因，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。

1.2.3 系统发育树建立 利用ClustalX 2.0.13软件对酿酒葡萄、小金海棠、落花生（Arachis hypgaea）、番茄、拟南芥、水稻、杜梨、柑橘（Citrus sinensis）、桃（Prunus persica）、梅（Prunus mume）、白杨（Populus trichocarpa）、萝卜、玉米（Zea mays）、马铃薯（Solanum tuberosum）和陆地棉（Gossypium hirsutum）15种植物的IRT同源蛋白进行氨基酸序列比对，利用MEGA 7.0中的最大相似法（maximum likelihood）构建系统进化树，分析遗传进化关系。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 利用NCBI/Primer-BLAST在线服务器，设计VvIRT1的特异性表达引物（上游引物：5'-GTGTAGGACTACTGAACGCC-3'，下游引物：5'-CAGACATGCCACCAGCACCC-3'），以葡萄Ubiquitin（GenBank：MH114011）为内参［23,26-29]，运用ABI 7500实时荧光定量PCR仪检测VvIRT1的组织特异性表达特征及其对不同铁素供应水平的响应差异。反应程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40个循环；72℃ 10 s。3次生物学重复，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量［23-29]。

1.2.5 酵母异源表达 设计构建重组表达载体引物，上游引物序列：5'-GACGGATCCATGGCAACTTCACC TCTCAAA-3'（下划线为BamH I限制性酶切位点），下游引物序列：5'-GAGTCTAGATCAAGCCCATTTT GCCATTACA-3'（下划线为Xba I限制性酶切位点），扩增VvIRT1的CDS目的片段，将其与植物表达载体pYH23（Biovector，北京，中国）连接［12,14,16]，获得重组质粒pYH23-IRT1，并进行双酶切验证。

酵母突变菌株DEY1453（MATα/MATα ade2/+canl/canl his3/his3 leu2/leu2 trpl/trpl ura3/ura3 fet3-2::HIS3/fet3-2::HIS3fet4-1::LEU2/fet4-1::LEU2）由于突变了fet3fet4位点，在缺失Fe2+的环境下不能正常生长［12,14-15]。根据Eide等［14]和Nakanishi等［12]的方法，将转化pYH23和重组质粒pYH23-IRT1的酵母细胞分别于液体YPD培养基（1% yeast extract、2% peptone、2% glucose和10 μmol/L Fe2SO4，pH 4.0）培养至OD600=1.0，经10倍梯度稀释成10-1、10-2和10-3浓度，分别取4个浓度梯度的菌液5 μL点样于缺失Fe2+的SD固体培养基（1% yeast nitrogen without amino acied和50 μmol/L bathophenanthroline disulfonic acid（BPDS），pH 5.5）上，30℃黑暗培养60 h，观察菌落生长情况并拍照。

1.2.6 数据分析 利用SPSS 13.0（SPSS Chicago,Ilinois，美国）对数据进行显著性分析，酿酒葡萄幼苗在胁迫处理与对照条件2个独立样品间进行t-检验（** P＜0.01）。

2 结果

2.1 VvIRT1的鉴定与克隆

以拟南芥AtIRT1的氨基酸序列为参考，在葡萄基因组数据库中检索到1个氨基酸一致性为78.5%的IRT同源蛋白，Pfam预测其含有Zinc/iron transporter（PF02535）功能结构域，编码典型的铁调节转运蛋白。依据葡萄基因组数据库获得VvIRT1的CDS序列，设计上下游引物进行扩增，获得一条约1000 bp条带，经测序，长度为1047 bp，命名为葡萄VvIRT1。

2.2 植物IRT同源蛋白系统发育树的构建

氨基酸序列比对结果表明，酿酒葡萄、小金海棠、落花生、番茄、拟南芥、水稻、杜梨、柑橘、桃、梅、白杨、萝卜、玉米、马铃薯和陆地棉15种植物IRT同源蛋白的序列一致性高达65.27%，并在6处Motif的功能域区段高度一致（图1），表明该蛋白在不同物种进化过程中的功能较为保守。

图1 不同植物IRT同源蛋白氨基酸序列的一致性分析Fig. 1 Amino acid sequence identity analysis of IRT homologs from different plant species

系统发育树构建结果表明,15种不同科、属植物的IRT同源蛋白之间的遗传进化距离差异较大。其中，4种蔷薇科植物（杜梨、小金海棠、桃和梅）的IRT同源蛋白聚在一支，禾本科水稻和玉米IRT同源蛋白倾向于聚在一支，十字花科拟南芥AtIRT1和AtIRT2分别与茄科番茄SlIRT1和十字花科萝卜RsIRT1紧密聚在一支，杨柳科白杨PtIRT1和豆科落花生AhIRT1紧紧聚在一支，而葡萄科VvIRT1、芸香科柑橘CsIRT1和锦葵科陆地棉GhIRT1紧密聚在一支，三者之间的遗传距离最近（图2）。

图2 不同植物IRT同源蛋白系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of IRT homologs from different plant species

2.3 VvIRT1的表达模式分析

实时荧光定量PCR分析结果（图3）表明，VvIRT1在5年生‘马瑟兰’新生根和组培幼苗根中特异表达，而成年树体新生叶片、新生韧皮部、花蕾期花朵、盛开期花朵、幼果和成熟果实及组培幼苗叶片和茎部的表达量极低。

图3 葡萄VvIRT1的组织特异性表达分析Fig. 3 Tissue-specific expression analysis of VvIRT1 in grape

2.4 VvIRT1对不同铁素供应的差异响应

以‘马瑟兰’组培幼苗为材料，通过进行不同铁素水平的胁迫，分析VvIRT1的表达模式，结果（图4）表明，与对照相比，缺铁处理显著诱导了VvIRT1在幼苗全部组织（根、茎部和叶片）中的表达，其中，在茎部和叶片中的表达量增加约3倍，而高铁毒害显著抑制了VvIRT1在幼苗根中的表达，对茎部和叶片中的表达量没有影响。

图4 VvIRT1对不同铁素供应水平的响应Fig. 4 Responses of VvIRT1 under different Fe supplies

2.5 VvIRT1的功能分析

构建重组表达载体pYH23-IRT1，转化酵母突变菌株DEY1453，结果（图5）表明，转化pYH23空白质粒的DEY1453菌株在缺失Fe2+的SD固体培养基平板上不能正常生长，而转化pYH23-IRT1重组质粒的DEY1453菌株在缺失Fe2+的SD固体培养基平板上能够正常生长，表明VvIRT1具有转运外界Fe2+的功能，进而恢复了DEY1453菌株的生长。

图5 VvIRT1的酵母功能互补验证Fig. 5 Verification on the functional complementation of VvIRT1 in yeast

3 讨论

植物正常生长所需的铁浓度为10-9-10-4mol/L，而正常pH土壤中，Fe2+和Fe3+的浓度一般不超过10-15mol/L，远远不能满足植物生长的需求［6,9]。果树学中，铁肥施放与果树生长、花开放、果实品质和产量密切相关，因此，研究果树铁素吸收与转运的分子机制具有重要的科学意义。目前，果树中铁吸收与转运的分子基础及其调控机制依然未知。葡萄属于双子叶植物，其铁吸收方式属于机制I［5-6,9-10]，但葡萄铁吸收与转运的相关分子机制尚未见报道。本研究从酿酒葡萄‘马瑟兰’中克隆并鉴定了1个铁调节转运蛋白VvIRT1，与已报道植物IRT同源蛋白在氨基酸水平的一致性很高（＞64%），暗示VvIRT1可能具有相似的铁调节转运蛋白的生物学功能，进一步的酵母功能互补试验证实VvIRT1具有转运外界Fe2+的功能，恢复了DEY1453菌株的生长。

本研究所选择的15种不同科、属的植物中，VvIRT1与柑橘CsIRT1和陆地棉GhIRT1之间的遗传距离最近，而同属于蔷薇科的桃、白梨、梅和小金海棠IRT1同源蛋白紧密聚集在一支，禾本科植物水稻和玉米IRT1同源蛋白倾向于聚在一支，而十字花科植物拟南芥和萝卜IRT同源蛋白紧密聚在一支，这些结果暗示同一科属或近属植物IRT同源蛋白在系统发育树上的遗传距离可能是更近的，并在长期进化过程中倾向于演化出相似或相近的生物学功能。因此，研究VvIRT1的功能可能为揭示葡萄科植物IRT同源蛋白的生物学功能提供理论支持。

特别地，VvIRT1在成年‘马瑟兰’树体根中和组培幼苗根中特异表达，这一发现与拟南芥AtIRT1和AtIRT2［14-16]、水稻OsIRT1和OsIRT2［11-12]、小金海棠MxIRT1［19]、萝卜RsIRT1［20]、杜梨PbIRT1［21]、落花生AhIRT1［30]在植物根部高量表达的情况基本一致。已有研究表明，缺铁胁迫显著增强了拟南芥AtIRT1［14]、萝卜RsIRT1［20]、小金海棠MxIRT1［19]、杜梨PbIRT1［21]、落花生AhIRT1［30]在根中的表达水平，与之相一致的是，本研究发现缺铁处理的确诱导了VvIRT1在幼苗全身不同组织中的表达量，再次暗示植物IRT基因在缺铁胁迫条件下更倾向于被诱导表达，以便最大限度地发挥转运Fe2+的活性，进而最大程度地维持酿酒葡萄根部铁吸收和转运功能，以保障依赖于铁的基本生命活动的运行，VvIRT1表达水平的升高可能是酿酒葡萄响应环境缺铁胁迫的信号之一。此外，本研究发现高铁毒害显著抑制了VvIRT1在幼苗根中的表达量，而地上部没有显著变化，再次印证VvIRT1表达水平的变化可能是酿酒葡萄适应环境中铁素供应水平的重要信号之一。

拟南芥AtIRT1具有广泛的底物运输特异性，酵母异源表达系统证实，AtIRT1可高效转运Fe2+、Mn2+、Cd2+和Zn2+离子，AtIRT2不直接参与从土壤中吸收Fe2+，可通过区室化储存以防止表皮细胞中依赖于AtIRT1吸收过多Fe2+而造成的毒害［14-16]。葡萄与拟南芥同属于机制I植物，虽然VvIRT1与拟南芥AtIRT1和AtIRT2在系统发育树上的遗传距离相对较远，但其与AtIRT1和AtIRT2在氨基酸水平的一致性分别超过了78%和72%。因此，拟南芥中IRT铁调节转运蛋白的生物学功能研究为解析酿酒葡萄IRT同源蛋白提供了技术借鉴。酵母突变菌株DEY1453由于突变了fet3fet4位点，在缺失Fe2+的环境中不能正常生长［12,14,16]，本研究借助酵母异源表达系统，将VvIRT1在酵母突变体中异源表达后，直接恢复了酵母突变体的生长情况，初步证实VvIRT1具有转运Fe2+的能力，具体转运机制和调控机理值得进一步深入研究。综上可知，本研究为揭示酿酒葡萄铁吸收和转运机制提供了基因资源，并为解析果树铁转调节运蛋白IRT的生物学功能奠定理论依据。

4 结论

从‘马瑟兰’中分离并鉴定了1个在根中特异性表达的基因VvIRT1，缺铁胁迫显著诱导其在幼苗全身的表达水平，而高铁毒害显著抑制了其在幼苗根中的表达水平；VvIRT1具有转运外界Fe2+的能力，恢复了酵母突变体的生长。