响应面法优化芡实醋酒精发酵阶段工艺条件

戴缘缘，谢小花，陈 静，肖陆飞，安晓婷

（滁州职业技术学院 食品与环境工程学院，安徽 滁州 239000）

芡实常被称为鸡头果、鸡嘴莲、鸡头米等[1]，除了富含淀粉、蛋白质、氨基酸、无机盐和维他命等营养成分之外[2-8]，还含有环肽类化合物、黄酮类化合物、甾醇类化合物等多种功效成分[9]．芡实具有抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗癌以及保护胃黏膜、抑菌、降糖、降压等生物活性[10-17]，具备很高的药理和开发价值．但目前对它的研究主要集中在化学成分和生理活性上，且市面上的芡实产品主要以速冻和干制等初级加工品为主，在发酵食品领域的开发利用较少，而以芡实为原料酿造食醋的研究更是鲜见报道[18]．芡实醋结合了芡实与食醋的营养价值和保健功能，符合人们对保健醋及其饮品的新期待和新要求，具有一定市场前景．

本研究以芡实为原料，经蒸煮、去壳、打浆、酶解后，接种酵母菌进行发酵，以酒精度为指标，采用响应面法优化芡实醋酒精发酵阶段工艺参数，旨在为芡实醋后续醋酸发酵阶段创造有利条件，从而丰富芡实精深加工发酵制品类型，拓宽功能性保健醋的种类，为芡实醋及其保健饮料的生产提供相关的数据支撑和经验参考．

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芡实鲜果（安徽天长市华富尊鸡头果有限公司）；家庭装干酵母粉（高活性、耐高糖型）（黑龙江九鼎酵母有限公司）；固态淀粉酶（耐高温、酶活为20 000 U/g）、固态糖化酶（酶活为100 000 U/g）、葡萄糖，以上全部为食品级（上海鑫泰实业有限公司）；甲醇、乙醇，以上级别全部为色谱纯（滕州中科谱分析仪器有限公司）．

1.2 仪器与设备

LLJ-C04W1 型榨汁机（佛山市小熊厨房电器有限公司）；FA2204 型电子天平（上海衡际科学仪器有限公司）；WB100-4F 型恒温定时水浴锅（宁波群安实验仪器有限公司）；XFS-280MB 型蒸汽灭菌锅（浙江新丰医疗器械有限公司）；LC-CJ-1FD 型全钢超净工作台（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；303-00 型升级版电热恒温培养箱（天津赛得利斯实验分析仪器制作厂）；TGL-16M 型台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；GC-2010 型气相色谱仪（日本岛津制作所）．

1.3 试验方法

（1）酒精度的测定

①色谱条件．色谱柱：DB-624 毛细柱（25 m×0.20 mm，1.12 μm）；其余条件包括升温程序、进样器温度、FID 检测器温度、进样量以及分流比等的具体参数均参考芋头醋酒精发酵阶段酒精度测定的色谱条件[19].

②标准曲线绘制．分别取1%（v/v）乙醇标准溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL，用甲醇定容至10 mL 并混匀，用针管推动过0.45 μm 的有机膜进行过滤，检测过滤后的样液，结束后记录仪器所产生谱图中的峰面积．对检测所得的数据进行处理后，得到标准曲线的具体方程为y= 3194.6x+ 48.678，其相关系数R2=0.999 9.

③样品处理及测定．在6 000 r/min 的条件下，将酒精发酵结束后的芡实浆液离心10 min，用甲醇稀释上清液至合适的稀释度，后续过滤及检测操作同上，测定芡实浆酒精发酵液中的酒精度．

（2）统计分析方法．每个试验都进行3 次平行操作，最终试验结果记录为平均值±标准差的表示形式．充分利用Excel 和Design-Expert 8.06 软件的数据处理及图表功能，先对试验结果进行统计分析，再进一步进行可视化分析．

2 试验方案设计

2.1 芡实醋发酵工艺及操作要点

（1）工艺流程

图1 芡实醋工艺流程

（2）操作要点

①芡实浆的制备．将无腐烂、无霉变、品质好的芡实清洗后蒸煮10 min．去壳后按料液比1 ∶2（W/W）加水，用榨汁机搅打制备芡实匀浆．

②酶解．向芡实浆中加入160 U/g 事先用浆液溶解的耐高温淀粉酶，85 ℃恒温液化处理2 h，升高温度灭酶后，加入用浆液溶解的糖化酶300 U/g，55 ℃恒温糖化处理2 h，灭酶后，获得芡实浆可发酵性糖液．

③酒精发酵．将芡实浆可发酵性糖液灭菌后，添加适量的葡萄糖，用以调整浆液糖度，接着调整浆液的pH 值，然后在无菌的超净台里接种活力良好的酵母菌，提供适宜的发酵条件，让酵母菌能够进行充分且高效的发酵，最终获得品质较好的芡实浆酒精发酵液．

④醋酸发酵及芡实醋成品的制备．酒精发酵阶段结束后，在135℃条件下灭菌10 s，并向灭菌后的芡实浆酒精发酵液中添加葡萄糖、蛋白胨等对醋酸菌有益的成分，同时将初始酒精度调整为8．00 %，然后在无菌条件下接种10 %醋酸菌沪酿1.01，于31℃保温发酵5.0 d，获得芡实浆醋酸发酵液，此时的总酸度为5.80 %．将芡实浆醋酸发酵液密封后室温放置15.0 d，进行陈酿，结束后添加0.45 %壳聚糖处理1 h，于6 000 r/min 离心5 min，将亮黄澄清的上清液虹吸至事先消毒好的玻璃容器中，加盖密封后，75 ℃水浴杀菌0.5 h，擦瓶并迅速冷却后制得芡实醋成品，可进一步调配出芡实醋饮料.

2.2 响应面法优化芡实醋酒精发酵阶段工艺

（1）单因素试验

①葡萄糖添加量的选择．向芡实浆可发酵性糖液中分别添加6、8、10、12、14 g/100 mL 的葡萄糖，酵母菌的接种量控制为0.2 %，在30℃的恒温箱中保温发酵4.0 d，分析芡实醋酒精发酵阶段浆液中酒精度随葡萄糖添加量的变化规律．

②接种量的选择．葡萄糖添加量取上述试验较好值，接种量分别取0.1 %、0.2 %、0.4 %、0.8 %、1.6 %，其他条件不变，分析芡实醋酒精发酵阶段浆液中酒精度随接种量的变化规律．

③发酵温度的选择．接种量取上述试验最好值，发酵温度分别取24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃，其他条件不变，分析芡实醋酒精发酵阶段浆液中酒精度随发酵温度的变化规律.

④发酵时间的选择．发酵温度取上述试验最好值，发酵时间分别取2.0 d、2.5 d、3.0 d、3.5 d、4.0 d，其他条件不变，分析芡实醋酒精发酵阶段浆液中酒精度随发酵时间的变化规律．

⑤pH 的选择．发酵时间取上述试验最好值，pH 分别取4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，其他条件不变，分析芡实醋酒精发酵阶段浆液中酒精度随pH 的变化规律．

（2）Box-Behnken 试验．以单因素试验所得的现象规律作为主要依据，进而利用Box-Behnken 响应面设计探索酒精发酵阶段工艺条件．筛选出的试验因素与其对应的水平编码见表1．完成相应试验以分析获得该发酵阶段最适工艺参数．

表1 芡实醋酒精发酵阶段Box-Behnken 试验因素及水平表

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

（1）葡萄糖添加量对芡实醋酒精发酵阶段的影响

由图2 可知，芡实浆发酵液的酒精度与葡萄糖添加量呈现明显的正相关关系，但葡萄糖添加量高于10 g/100 mL 以后酒精度的升高幅度有所下降，葡萄糖添加量12 g/100 mL 时酒精度为7.70 %，葡萄糖添加量14 g/100 mL 时酒精度仅为8.20 %．造成这种现象的可能原因是，芡实浆的渗透压因还原糖浓度升高而过高，酵母菌对糖分的利用受到抑制，浆液中残留的糖分反而增多，酒精产量降低．同时葡萄糖添加量过大还会较大程度的增加成本，使生产过程产生浪费．考虑到此阶段过高的酒精积累反而会抑制下一阶段醋酸发酵过程中菌体的生长，进而降低醋酸的生成量，最终影响芡实醋的酿造品质．因此，后续试验的探究中葡萄糖添加量均定为10 g/100 mL 而不再改动．

图2 葡萄糖添加量对芡实浆发酵液酒精度的影响

（2）接种量对芡实醋酒精发酵阶段的影响

由图3 可知，当接种酵母菌量在一定范围内不断增大时，芡实浆发酵液中酵母产酒精的量不断升高，并在菌量为0.40 %时达到峰值7.30 %，而后接种量继续增大，酒精度不增反降．因为接种量较少时，酵母菌无法形成群体优势，而且还容易被其他与主发酵无关的杂菌所污染，环境适应较慢，菌体生长表现出较为缓慢的状态，主发酵时间被一定程度拉长；但接种量绝不是越大越好，不然芡实浆中一部分营养成分会被酵母菌的生长、繁殖所消耗，因而留给菌体发酵的糖分有所减少，使得整体酒精度明显降低，此外大量代谢废物的累积引起发酵环境的劣变也使酵母菌无法很好的继续发酵产酒精．因此，接种量选择0.40 %为宜．

图3 接种量对芡实浆发酵液酒精度的影响

（3）发酵温度对芡实醋酒精发酵阶段的影响

由图4 可知，发酵温度较低时，芡实浆发酵液的酒精度跟温度的变化一致，且在30 ℃时达到峰值7.58 %，当温度越过30 ℃以后，酒精度跟温度的变化相反．这可能是因为外界环境温度较低时，酵母菌无法充分发挥其发酵活力，其代谢糖分的速率不高，完成主发酵所需的时间相对延长；温度较高时，酵母菌虽然前期急剧生长，但菌体衰老也将相应提前，不利于发酵产物酒精的积累，此时芡实浆发酵液也极易感染杂菌导致最终风味不良．此外，醇类、酯类、酸类等对发酵液风味有益的挥发性物质的产生和积累都需要在较低的温度条件下进行，因此发酵温度选择30 ℃为宜.

图4 发酵温度对芡实浆发酵液酒精度的影响

（4）发酵时间对芡实醋酒精发酵阶段的影响

由图5 可知，发酵初期特别是前1.0～2.0 d，芡实浆发酵液酒精度急剧增加同时伴随着大量气泡产生，发酵2.0～3.0 d，酒精度继续增加但速度有所下降，发酵3.0 d 以上，酒精度变化不大，基本维持在7.76 %．这主要是因为发酵前3.0 d，芡实浆中营养充足且pH 适宜，酵母菌在此良好环境下能旺盛的生长、繁殖并进行正常的代谢，酒精含量不断增加，直至芡实浆液中养分被消耗殆尽．发酵3.0 d 以后，发酵环境不适大大影响酵母菌的活力，直至发酵过程终止酒精度都变化不大．因此，发酵时间选择3.0 d 为宜.

图5 发酵时间对芡实浆发酵液酒精度的影响

（5）pH 对芡实醋酒精发酵阶段的影响

由图6 可知，芡实浆发酵液的酒精度在一定pH 值范围内先逐渐增加，达到峰值7.85 %后随pH 值的继续增加而明显下降．这可能是因为不适宜的pH 值，易引发酵母菌异常的生长和代谢，进而影响芡实浆发酵液中酒精的积累．此外，过酸的条件往往伴有刺激性酸味，且不利于酯类物质的稳定存在，这些都会严重影响芡实浆发酵液的风味；pH 过高使得发酵液的色泽偏深，不利于芡实浆发酵液的感官品质．因此，pH 选择5.5 为宜.

图6 pH 对芡实浆发酵液酒精度的影响

3.2 芡实醋酒精发酵阶段响应面试验结果与分析

（1）响应面设计、结果及方差分析．芡实醋酒精发酵阶段Box-Behnken 设计方案与对应的试验结果见表2．方差分析具体情况见表3．

表2 芡实醋酒精发酵过程Box-Behnken 设计与对应结果

表3 回归模型的方差分析表

各发酵参数与芡实醋酒精发酵阶段浆液中酒精度之间的回归模型构建如下：

分析表3 数据和结果可知：该模型的P值小于0.000 1，因此极显著，且失拟项的P值为0.069，因此不显著；校正决定系数为0.968 1，即本试验所选取的4 个变量可以解释芡实浆酒精发酵液酒精度96.81 %的变异性；精密度RSN为25.25，即本试验的精密度合理．以上分析表明，该回归方程无论是拟合度还是可信度都很高，因此能较准确的分析和预测芡实醋酒精发酵阶段的酒精度．

（2）交互作用影响．芡实醋酒精发酵阶段不同因素两两之间的交互作用，可通过3D 响应面图和与之相对应的等高线图来体现．这样立体图和平面图的表达形式也使得交互作用对试验指标酒精度的影响规律变得更易观察．

图7 中a1和a2体现的是发酵各条件中，仅分析接种量X1与发酵温度X2对芡实浆酒精发酵液酒精度的影响规律．a1图呈现较明显的陡坡，且投影得到的a2图是非常明显的椭圆形，这些都意味着两参数的交互作用是显著的．从a2图还可以看出，酒精度沿发酵温度轴向改变的更为稠密，即试验指标酒精度受该因素影响相较于接种量更大一些．图7 中b1所示的双曲面同样较为陡峭，b2所示的是与b1相对应的椭圆形等高线，b1和b2共同体现出发酵的温度X2及时间X3具有明显的交互影响．继续分析可知，试验指标酒精度随因素发酵时间的变化幅度明显小于发酵温度，这就说明芡实醋酒精发酵阶段的酒精度受发酵温度的影响更大．图7 中c1和c2反映在发酵温度保持一定的情况下，芡实醋酒精发酵阶段试验指标酒精度随pH 值的升高呈现先增后减的变化趋势；而在pH 值保持一定的情况下，芡实醋酒精发酵阶段试验指标酒精度随发酵温度的提高也呈现出先增后减的变化趋势.由图分析发现，发酵温度X2和pHX4的交互较为明显，且发酵温度对芡实醋酒精发酵阶段试验指标的影响更大．

图7 不同交互作用对芡实浆发酵液酒精度影响的响应面3d 图及等高线平面图

（3）响应面验证试验．由回归模型分析可知，当所探究的发酵参数选取为接种量0.41 %，发酵温度30.84 ℃，发酵时间2.97 d，pH 5.58 时，可得到最大响应值8.14 %.为了实验更好操作和实施，也为了实验的准确性和可控性，故将发酵工艺条件进行近似调整为接种量0.40 %，发酵温度31.0 ℃，发酵时间3.0 d，pH5.6．按照修正后的参数开展验证实验，测得芡实醋酒精发酵结束后浆液中的酒精度为（8.09±0.05） %．此结果恰好在区间[8.06 %，8.23 %]内，即在95 %预测区间内，表明在所选的试验范围内，该模型是比较可靠和可信的.

4 结 论

利用天然食材中的生物活性成分结合优良菌种的发酵作用酿造保健醋，进而开发保健醋饮料，是未来醋饮发展的趋势和潮流．芡实因其独特的功效性，作为保健醋的开发原料研究前景广阔．在葡萄糖添加量10 g/100 mL，接种量0.40 %，发酵温度31.0 ℃，发酵时间3.0 d，pH 5.6 的条件下，芡实醋酒精发酵液酒精度可达（8.09±0.05）%．灭菌后调整成分，接种醋酸菌继续发酵，可制备酸度适宜、色泽亮黄的芡实醋成品．本研究可为芡实醋及其饮料的开发打下良好基础.