可溶性CD83促进耐受性DCs和Treg细胞增殖和免疫耐受的分子机制

宋奇锋,高良辉,李 望,张译中

由于移植后免疫抑制等方法的改进,肝移植后的存活率逐步提高,并已成为终末期肝病的主要治疗方法。肝移植后,需要长期进行免疫抑制,以避免严重的急慢性排斥反应和移植物丢失。目前,免疫抑制剂仍主要为钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitors,CNIs),但存在移植后并发症如肾损伤、新发癌症、病原体感染等[1-2]。未来需要开发新的针对特定炎症细胞的选择性免疫抑制剂。CD83是免疫球蛋白超家族成员,有膜结合或可溶性形式两种。可溶性CD83(soluble CD83,sCD83)具有免疫抑制功能[3-5]。抗CD83特异性抗体在移植物抗宿主病(graft-vs-host disease,GVHD)的临床前模型中显示出良好的功效,且不会影响病毒或肿瘤特异性记忆T细胞的反应[6]。但二者具体的作用方式和机制仍不清楚。该研究拟探讨sCD83对未成熟树突细胞(dendritic cells,DCs)和调节性T(regulatory T,Treg)细胞数量和比例的影响,以及其发挥免疫抑制的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 2只6～8周龄C57B/6小鼠,体质量(22±3)g,购自海南省药物研究所有限责任公司;实验动物生产许可证号:SCXK(琼)2020-0007。小鼠饲养于恒温(23±2)℃、恒湿、12 h/12 h光/暗循环的标准SPF级鼠房,饲喂啮齿类动物标准饲料,自由进食和饮水。

1.1.2试剂与仪器 sCD83(货号:SRP6207)、重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(货号:SRP3201)、重组小鼠白细胞介素(interleukin,IL)-4(货号:SRP3211)、蛋白酶抑制剂混合物(P8465)购自美国Sigma-Aldrich公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(货号:16140071)、RPMI-1640(货号:31800022)购自美国Thermo Fisher公司;细胞核蛋白提取试剂盒(P1202-50)购自北京普利莱生物有限公司;Alexa fluor 488标记的兔抗小鼠CD40(货号:ab302971)、CD86(货号:ab290990)、CD83(货号:ab286828)、Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex class Ⅱ,MHC Ⅱ)(货号:ab203323)、Alexa fluor 488标记的兔IgG单抗(货号:ab199091)、FITC标记的抗CD4单克隆抗体(货号:ab59474)、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗CD25单克隆抗体(货号:ab210335)、抗FOXP3单克隆抗体(货号:ab218773)以及兔抗小鼠-磷酸酶和张力蛋白同源物单抗(phosphatase and tensin homolog,PTEN)(货号:ab267787)、兔抗小鼠蛋白激酶B单抗(protein kinase B,Akt)(货号:ab283852)、兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-Akt)单抗(Thr 308)(货号:ab8933),兔抗小鼠核因子κB亚基RelB单抗(货号:ab33907),兔抗小鼠程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death 1,PD-1)单抗(货号:ab52587)购自美国Abcam公司;淋巴细胞分离液(货号:70-HLSM1077)购自杭州联科生物公司;CD4+T细胞分离试剂盒(货号:130-091-301),抗FITC MicroBeads(货号:130-048-701),抗PE MicroBeads(货号:DXT-130-097-054),LS+磁珠分选柱(货号:130-042-401),MiniMACS Starting Kit(货号:130-090-312)购自德国Miltenyi Biotec公司;小鼠IL-10(货号:ml037888)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)(货号:ml057830)、IL-12(货号:ml037881)和犬尿酸(货号:ml042437)ELISA试剂盒购自上海酶联生物有限公司;流式细胞仪(型号:Calibur)购自美国BD公司;酶标仪(型号:Synergy H4)购自美国BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1体外细胞实验分组和处理方法 体外细胞实验分为2组:Control组,向细胞培养物中加入10 μl PBS处理;sCD83组:向细胞培养物中加入10 μl 10 μg/ml的可溶性CD83(溶解于PBS缓冲液)处理[7]。

1.2.2DCs的分离和培养 从C57B/6小鼠骨髓祖细胞培养骨髓衍生的DCs。实验方法为:通过CO2窒息法安乐死小鼠,分离其股骨和胫骨,使用冰预冷的PBS缓冲液将其中的骨髓冲洗下来,置于10 ml离心管中,于4 ℃以220 r/min离心10 min,收获细胞沉淀。使用补充有15% FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀并转移至6孔板中,添加含有100 U/ml青链霉素的RPMI-1640+15%FBS培养液,并加入终浓度均为10 ng/ml的重组小鼠GM-CSF和重组小鼠IL-4,置细胞于37 ℃恒温湿润的CO2细胞培养箱中对其进行培养。次日去除非贴壁细胞并更换为新鲜的含有终浓度均为20 ng/ml重组GM-CSF和10 ng/ml重组小鼠IL-4的RPMI-1640+15%FBS培养液继续培养。每隔1 d更换1次新鲜培养液,3 d后开始收获松散贴壁的聚集增殖的DCs[7]。

1.2.3流式细胞术测定DCs表面标志物 DCs用Alexa fluor 488-标记的兔抗小鼠CD40、CD86、CD83、MHC Ⅱ单克隆抗体进行染色,Alexa fluor 488标记的兔IgG单抗作为Isotype control。然后使用Calibur流式细胞仪对表达对应表面标志物的细胞进行计数。

1.2.4Treg细胞的分离和流式细胞术分选 通过CO2窒息法安乐死小鼠,取小鼠脾脏,放入盛有Hank′s溶液的细胞培养皿中。使用组织研磨棒在200目的尼龙筛网上旋转挤压脾脏,使组织内的细胞通过筛网。然后去掉尼龙筛网,将细胞悬液收集至一个15 ml离心管中,于4 ℃以2 000 r/min离心5 min,弃上清液。向细胞沉淀中加入5 ml红细胞裂解液,充分重悬细胞沉淀,于室温孵育2 min,于4 ℃以2 000 r/min离心5 min,弃上清液。加入冰预冷的Hank′s溶液再次重悬细胞沉淀,加入淋巴细胞分离液,离心使细胞分层,吸取血浆和淋巴细胞分离液之间的单核细胞层,其中含有淋巴细胞和单核细胞。加入等体积Hank′s溶液稀释单核细胞层,室温以800 r/min离心10 min,保留细胞沉淀,弃上清液。再次加入Hank′s溶液重悬细胞沉淀。使用CD4+T细胞分离试剂盒纯化CD4+CD25-和CD4+CD25+T细胞,即Treg细胞。将细胞重悬于含牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS缓冲液(pH 7.2,另含0.5%BSA和2 mmol/L EDTA)中。淋巴细胞用FITC-标记的抗-CD4单抗和抗-FITC MicroBeads标记,然后在LS+磁珠分选柱上纯化。然后CD4+T细胞与MiniMACS Starting Kit中的释放试剂共同孵育,去除结合的微珠。使用PE标记的抗CD25单抗和抗PE MicroBeads分选CD4+CD25+T细胞。通过流式细胞术使用PE-标记的抗-FOXP3单抗分析T细胞,分选并计数CD4+CD25+FOXP3+T细胞,即Treg细胞。

1.2.5Treg细胞核和胞质蛋白提取 使用细胞核蛋白提取试剂盒提取Treg细胞核蛋白。收集分选获得的Treg细胞,每次提取(1～2)×107个细胞/样品。在4 ℃下以880 r/min离心细胞5 min。加入1 ml冰预冷的试剂盒自带的Buffer-1,振荡重悬细胞,冰水浴孵育5 min。加入50 μl试剂盒自带的Reagent-A试剂,剧烈振荡混合,冰水浴孵育5 min。然后再次剧烈振荡。使用22号针头反复多次抽吸细胞裂解物,利用剪切力充分裂解细胞。在光学相差显微镜下观察未裂解细胞应少于5%,然后进行下一步。将制备好的细胞匀浆物转移至一个新的EP管中,在4 ℃下以1 100 r/min离心细胞3 min,然后再在4 ℃下沉淀细胞核;上清液为细胞质溶液,转移至一个新EP管中,备用。加入0.5 ml试剂盒自带的Buffer-2重悬细胞核。在4 ℃下以2 200 r/min离心细胞10 min,洗细胞核。重复洗细胞核1次。在光学相差显微镜下观察细胞核应游离分散于清亮背景下,而无颗粒物质(此为细胞质成分残留)。弃上清液,用100 μl试剂盒自带的缓冲液重悬细胞核,进行下游细胞核总蛋白的提取。使用RIPA裂解液分别裂解细胞质和细胞核提取物,随后按照标准操作分别提取其总蛋白质即可。

1.2.6混合淋巴细胞反应 将来源于小鼠骨髓的原代同种异体骨髓衍生DCs与分离获得的CD4+T细胞按照DC ∶T细胞=1 ∶5的比例进行混合,置于6孔板中共培养。向混合细胞中添加RPMI-1640+10% FBS的完全培养液,连续共培养3 d,收集细胞培养物上清液,进行下游ELISA测定。

1.2.7ELISA测试 按照试剂盒说明书给出的操作指南,使用小鼠IL-10、TGF-β、IL-12和犬尿酸ELISA试剂盒对细胞上清液中的相应项目成分进行测定。使用酶标仪进行检测。

1.2.8Western blot检查 使用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)对细胞进行裂解,提取其总蛋白质。室温下使用含10%脱脂奶粉的TBS缓冲液对PVDF膜进行封闭1 h。随后向PVDF膜上滴加一抗工作液,于4 ℃共同孵育过夜。次日向PVDF膜上滴加二抗工作液,于室温共同孵育1 h。抗体工作浓度如下:PTEN(稀释度1 ∶1 500),p-Akt(Thr 308)(稀释度1 ∶1 000),Akt(稀释度1 ∶1 500),细胞核RelB(稀释度1 ∶2 000)、细胞质RelB(稀释度1 ∶1 500)、PD-1(稀释度1 ∶1 000)。使用ECL化学发光底物对目的条带进行显影。

2 结果

2.1 sCD83促进未成熟DCs(immature DCs,imDCs)增殖并上调吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的表达与Control组相比,sCD83组表达表面标志物CD40、CD83、CD86、MHC Ⅱ的DCs细胞计数降低(P<0.05),见图1A、B。Western blot结果显示,分选获得的低表达CD40、CD83、CD86、MHC Ⅱ的imDCs胞内IDO的表达水平升高(P<0.05),见图1C、D。ELISA结果显示,与Control组相比,sCD83组DCs细胞培养上清液中犬尿酸的水平升高(t=11.12,P<0.05),见图1E。

2.2 sCD83促进Treg细胞增殖并调节PTEN/Akt通路流式细胞术结果显示,与Control组相比,sCD83组CD4+CD25+FOXP3+T细胞,即Treg细胞计数升高(P<0.05),见图2A、B;Western blot结果显示,与Control组相比,分选获得的Treg细胞内PTEN的表达水平升高(P<0.05),p-Akt (Thr 308)的表达水平降低(P<0.05),Akt的表达水平无明显变化,见图2C、D。

图2 体外培养CD4+ T细胞中Treg细胞的定向分化情况测定A、B:流式细胞术测定体外培养CD4+ T细胞中Treg细胞的定向分化情况结果图和统计结果柱状图;C、D:Western blot测定分选获得的Treg胞内PTEN、p-Akt和Akt蛋白质的表达水平结果图和统计结果柱状图;a:Control组;b:sCD83组;与Control组比较:*P<0.05

2.3 sCD83抑制Treg细胞核内RelB并下调PD-1的表达Western blot结果显示,分选获得的Treg细胞核内RelB的表达水平降低(P<0.05),胞质RelB的表达水平升高(P<0.05),PD-1的表达水平降低(P<0.05)。见图3A、B。

图3 Treg细胞中RelB和PD-1的表达情况测定A、B:Western blot测定分选获得的Treg细胞核内、胞质内RelB和PD-1的表达情况结果图和柱状图统计结果;a:Control组;b:sCD83组;与Control组比较:*P<0.05

2.4 sCD83对imDCs与Treg细胞共培养物中免疫抑制因子的表达水平的影响用ELISA测定imDCs与CD4+T细胞共培养物上清液中IL-10、TGF-β和IL-12的水平,与Control组相比,sCD83组IL-10和TGF-β的水平升高(P<0.05),IL-12的水平降低(P<0.05)。见图4。

3 讨论

DCs是高度特化且功能多样的抗原呈递细胞(APCs),负责控制先天性和适应性免疫反应。DCs起源于骨髓祖细胞,可通过不同刺激分化为免疫反应性或免疫耐受性DCs。在器官移植中,DCs在决定移植器官的命运方面发挥着至关重要的作用:宿主对移植器官的排斥或接受,取决于DCs的免疫耐受性或免疫反应性功能[8]。研究[8]显示,免疫耐受性DCs与同种异体移植物的存活率呈正相关,在非人灵长类动物的各种器官移植模型中,免疫耐受性DCs能够延长同种异体移植物的存活率。已有研究[9]显示,通过调节细胞表面分子防止DCs成熟可维持DCs的免疫耐受性,imDCs在维持免疫耐受中十分关键。与成熟DCs相比,imDCs表面标志物CD40、CD83、CD86和MHC Ⅱ表达下调。本研究结果显示,与Control组相比,sCD83处理后表达表面标志物CD40、CD83、CD86、MHC Ⅱ的DCs细胞计数所占百分比降低,表明在DCs细胞群内,有更多的imDCs,进而可能会介导维持机体的免疫耐受状态。

Treg细胞是CD4+CD25+FOXP3+T细胞,在人和小鼠中来源于胸腺和外周CD4+T细胞。Treg细胞在维持宿主免疫耐受方面也发挥重要功能。Treg细胞可以通过释放TGF-β和IL-10,下调IL-12的表达使DCs保持未成熟状态[10]。转录因子RelB是核因子-κB家族成员,在介导免疫反应中起关键作用。在细胞水平上,RelB表达主要限于DCs、T细胞、B细胞和单核细胞中。当其转位至细胞核中,RelB作为核因子-κB转录因子的组分发挥促进DCs成熟的功能;而胞质内RelB为无活性状态[11]。与髓源性DCs成熟相关的表面标志物,如MHC Ⅱ、CD80、CD86和CD40,在RelB缺陷型小鼠中表达减少[12]。本研究结果显示,与Control组相比,sCD83处理后imDCs与CD4+T细胞共培养物上清液中IL-10和TGF-β的水平升高,IL-12的水平降低,且sCD83能够下调CD4+T细胞核内RelB的水平。说明sCD83可能通过调节CD4+T细胞核内RelB的水平,调控相关细胞因子的表达,从而促进imDCs与Treg细胞协同作用,增强两种细胞发挥免疫耐受活性的功能。

IDO是免疫调节因子,并且与色氨酸代谢相关。IDO可促进色氨酸分解为犬尿酸并调节Treg细胞的分化,以维持T细胞的免疫耐受性[13]。与此同时,微环境中的犬尿酸水平升高也能通过正反馈回路促进IDO的上调表达。干扰素-γ可通过激活Toll-样受体3(TLR3)-依赖的IDO/犬尿酸通路增强犬骨髓间充质干细胞的免疫耐受能力[14]。本研究中也显示,sCD83处理后,imDCs胞内IDO的表达水平上调,并促进了DCs细胞群培养物上清液中犬尿酸的水平。说明sCD83也能通过调节IDO和犬尿酸的水平对DCs发挥免疫抑制功能。

最近的报道[15]显示,在体实验中PD-1调节Treg细胞的免疫抑制功能,PD-1表达缺陷后Treg细胞的免疫抑制功能得以发挥,从而改善了实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠和糖尿病小鼠的疾病进展,说明了PD-1表达缺陷对于强效发挥Treg细胞免疫抑制功能的体内意义。本研究结果也支持这一研究结论,与Control组相比,sCD83处理后下调了PD-1的表达水平。小鼠Treg细胞中PTEN基因缺失会破坏Treg细胞的免疫耐受性表型的稳定性,这会阻止移植物或肿瘤在其微环境中形成免疫耐受[16]。p-Akt抑制Treg细胞的发育[17]。相对高水平的Treg细胞对于宿主免疫耐受十分重要,而本次研究结果表明,sCD83能够通过下调核内RelB的水平、上调PTEN,抑制PD-1和Akt,促进CD4+T细胞向Treg细胞的分化,维持免疫耐受状态。

基于以上研究,推断sCD83的免疫抑制活性,很可能是通过调节CD4+T细胞核内RelB的水平,促进其向Treg细胞方向分化,调节细胞因子IL-10、TGF-β和IL-12的分泌,影响DCs和Treg细胞的细胞间通讯,并影响IDO和PD-1的表达和PTEN/Akt通路的活性,以进一步维持免疫耐受状态所需要的imDCs和Treg细胞的细胞数量和比例。即sCD83能够通过抑制Treg细胞核内RelB的水平调节相关细胞因子的分泌影响DCs和Treg细胞的细胞间通讯,促进耐受性imDCs和Treg细胞的增殖。然而,该研究未深入探索sCD83调节核内RelB的水平的具体分子机制,这是进一步要研究的内容。