塞来昔布下调JAML抑制糖尿病视网膜病变大鼠VEGF的表达及其机制

段 梅,曹 凡,桂衍超,陈可洋,陶黎明,蒋正轩

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病眼病的主要并发症之一,已成为我国成年人群致盲的首位疾病[1]。DR发病率高、病因复杂,发病机制尚不完全清楚。研究[2]表明,慢性炎症和高糖导致的视网膜缺氧在DR的发病过程中发挥重要的作用。塞来昔布是一种选择性非甾体消炎药,广泛用于抗炎和镇痛等治疗。Amrite et al[3]研究证实眼周注射塞来昔布可抑制DR视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的升高,但其机制并不清楚。连接黏附分子样蛋白(junctional adhesion molecule-like protein, JAML)主要表达于肾小球足细胞、心血管内皮细胞[4-5]。研究[6]显示,JAML不仅增强白细胞和内皮细胞的黏附作用,还可以介导细胞内炎症反应,在炎症和损伤修复中发挥关键作用。目前,塞来昔布减轻DR发生的机制尚不清楚。该研究将在DR中研究塞来昔布对JAML表达的影响,以及塞来昔布对DR视网膜VEGF的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级8周龄雄性SD大鼠45只,体质量180～200 g(安徽医科大学动物实验中心提供),大鼠置于12 h/12 h光照黑暗交替、温度(25±1)℃、湿度(50±5)%的环境下,自由进食饮水,适应性喂养1周。该研究获得安徽医科大学第二附属医院科研和临床试验伦理委员会批准(编号:2021049)。遵守实验动物使用原则、护理原则及3R原则使用实验动物。

1.1.2主要试剂与仪器 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、HE染色试剂盒(货号:1120)购于北京索莱宝科技有限公司;枸橼酸钠、枸橼酸三钠、戊巴比妥均购自北京国药集团化学有限公司;塞来昔布购于美国辉瑞制药有限公司;原代人脐静脉内皮细胞(primary human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)和ECM培养基购自美国sciencell公司;胎牛血清由以色列BI公司提供;D-葡萄糖购于德国biofroxx公司;0.25%胰酶细胞消化液(货号:C0203)、青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(货号:C0223)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0010)均购自上海碧云天生物有限公司;无血清细胞冻存液(货号:C40100)购于苏州新赛美生物科技公司;Anti-JAML抗体(货号:ab183714)购自英国Abcam公司;抗磷酸化磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositol kinase-3,P-PI3K)抗体(货号:AF3242),抗磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidy-linostiol kinase-3,PI3K)抗体(货号:AF6242),抗缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor1-α,HIF1-α)抗体(货号:BF8002),抗白介素-10抗体(DF6894),抗VCAM-1抗体(DF6082)均购自溧阳亲科生物公司;抗VEGF抗体(货号:R26074)购自成都正能生物公司;总胆固醇(total cholesterol,TC)检测试剂盒(货号:A111-1-1)购自南京建成公司;胰岛素(Insulin)检测试剂盒(货号:CSB-E05070r)购于武汉华美科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠糖尿病模型建立 将45只大鼠随机分为3组,分别为正常对照(NC)组、DR组、塞来昔布干预DR(DR+C)组,每组15只。DR组和DR+C组大鼠按60 mg/kg剂量腹腔注射STZ(以pH为4.5的0.1 mmol/L的枸橼酸盐缓冲液稀释),NC组注射等量枸橼酸盐溶液。注射3 d后禁食8 h,采尾静脉血测血糖浓度,以空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)>16.7 mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。FPG<16.7 mmol/L大鼠继续普通饲料喂养1周,重复造模,用2周造模成功。建模1个月后使用塞来昔布以50 mg/kg剂量每日单次灌胃,连续2个月。每周1次观察并记录3组大鼠进食量,饮水量及精神状态;每周测量1次体质量、1次FPG。

1.2.2SD大鼠视网膜组织病理变化 按5 ml/kg剂量腹腔注射1%的戊巴比妥钠全身麻醉SD大鼠,摘取右侧眼球,4%多聚甲醛固定24 h后流水冲洗,梯度乙醇脱水后用二甲苯透明并透蜡,然后包埋;沿矢状面垂直视神经做石蜡切片,切片厚度3 μm;脱蜡后苏木素染色3 min,自来水返蓝,伊红染色,使用中性树胶封片。400倍光学显微镜下观察拍照。

1.2.3免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)检测SD大鼠视网膜组织中白介素(interleukin,IL)-10、血管细胞黏附分子-(vascular cell adhesion molecules-1,VCAM-1)蛋白表达 每组选取3张石蜡切片,进行IHC实验。60 ℃恒温烘烤切片,脱蜡、梯度乙醇(100%-95%-80%)浸洗3次,之后流水冲洗切片至透明;将切片放入高压锅中,2 min后取出,滴加3%H2O2室温孵育10 min,PBS-T洗3次,山羊血清室温封闭20 min,甩干后滴加IL-10(1 ∶150)、VCAM-1(1 ∶100)一抗,37 ℃孵育1 h;取出滴加二抗孵育,洗净后滴加DAB显色剂。苏木精染色,常规脱水,封片。使用Image J软件计算每张切片中阳性染色区域的平均灰度值,代表蛋白的表达情况。

1.2.4Western blot法检测JAML、PI3K、P-PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白在大鼠视网膜组织的表达 称取视网膜组织20 mg,加入RIPA裂解液匀浆,离心,取上清液,BCA蛋白浓度测定试剂盒检测总蛋白含量。按每孔20 μg上样量进行Western blot实验。使用Image J软件分析各条带灰度值。目的蛋白表达量=目的条带灰度值/相对应内参灰度值。

1.2.5检测血清中TC、Insulin含量 SD大鼠糖尿病建模3个月末,1%戊巴比妥钠麻醉SD大鼠,经眶静脉取空腹血,4 ℃凝固后,3 000 r/min离心10 min, 取上层血清检测TC、Insulin含量。

1.2.6细胞培养 取出液氮冻存的HUVEC细胞放入37 ℃水浴锅解冻,然后转移至含有ECM完全培养基的离心管中,离心,弃上清液;完全培养基重悬细胞,接种到培养瓶中,于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养,待细胞融合至80%时使用0.25%胰酶细胞消化液消化,终止消化后收集细胞,并制成单细胞悬液。按每孔2.5×105个细胞含量接种于6孔板中培养24 h。将细胞分为3组:正常葡萄糖(normal glucose,NG)组细胞采用无血清培养基培养,高糖(high glucose,HG)组细胞在含有30 mmol/L的葡萄糖无血清培养基中培养,高糖加药塞来昔布(high glucose and celecoxib,HG+C)组细胞在含有30 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L塞来昔布的无血清培养基中培养。塞来昔布溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。

1.2.7Western blot法检测3组细胞JAML、PI3K、P-PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白的表达 将处理后的细胞培养24 h,使用细胞刮收集细胞,提取细胞总蛋白,按每孔20 μg蛋白含量进行Western blot实验。用Image J软件分析各条带灰度值以计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 3组SD大鼠体质量、血糖、饮食、饮水的变化情况NC组大鼠毛发明亮,体型肥硕;DR+C组、DR组大鼠体型瘦削,毛色暗淡。DR+C、DR组大鼠体质量均低于NC组(F组别=39.13,P<0.01),而DR+C组与DR组差异无统计学意义(图1A和表1)。DR+C组、DR组FPG水平均高于NC组(F组别=318.7,P<0.01),而DR+C组与DR组FPG水平差异无统计学意义(图1B和表1)。DR+C组、DR组12 h进食量与NC组比较差异无统计学意义(F组别=1.704,P>0.05)(图1C和表1);DR+C、DR组12 h饮水量较NC组增多(F组别=9.438,P<0.05)(图1D和表1)。

图1 3组SD大鼠体质量、FPG、饮食、饮水变化情况A:体质量;B:FPG;C:饮食;D:饮水

2.2 3组SD大鼠视网膜组织病理变化情况NC组细胞排列整齐,结构层次清晰;DR+C组和DR组视网膜疏松,层间结构不清;DR组大鼠视网膜血管扩张,内界膜不连续。3组大鼠视网膜厚度分析显示:DR+C组视网膜厚度、内丛状层(IPL)、内核层(INL)、外丛状层(OPL)、外核层(ONL)厚度低于DR组(P<0.05);DR+C组与NC组视网膜厚度、内核层、内丛状层厚度差异无统计学意义。见图2。

2.3 3组SD大鼠视网膜组织中IL-10、VCAM-1蛋白表达情况对3组大鼠进行干预2个月后,采用IHC检测视网膜组织中IL-10、VCAM-1的蛋白表达水平。结果显示,DR组IL-10、VCAM-1蛋白表达水平高于NC组(分别为P<0.001,P<0.01),DR+C组大鼠视网膜中IL-10、VCAM-1蛋白表达水平低于DR组(均P<0.01)。见图3。

图3 3组SD大鼠视网膜组织中IL-10、VCAM-1蛋白表达情况 ×400A、B:IHC检测视网膜组织中IL-10的蛋白表达及其直方图;C、D:IHC检测视网膜组织中VCAM-1的蛋白表达及其直方图;a:NC组;b:DR组;c:DR+C组;黑色箭头:指示阳性染色;与NC组比较,**P<0.01,***P<0.001;与DR+C组比较:##P<0.01

2.4 3组SD大鼠血清TC、Insulin含量变化情况3组SD大鼠进行干预2个月后,检测大鼠血清TC、Insulin含量。DR+C组、DR组血清TC含量较NC组升高(P<0.01);而DR+C组与DR组相比差异无统计学意义。DR+C组和DR组中血清Insulin含量较NC组均下降(P<0.001);DR+C与DR组相比差异无统计学意义。见图4。

图4 3组大鼠血清TC、Insulin量变化情况A:TC; B:血清Insulin;与NC组比较:**P<0.01,***P<0.001

2.5 3组SD大鼠视网膜中JAML、VEGF表达水平及PI3K/ HIF1-α信号通路的分子表达情况Western blot法检测JAML和VEGF的表达水平,结果显示:DR组中JAML和VEGF蛋白表达水平高于NC组(P<0.001);DR+C组JAML、VEGF的表达水平低于DR组(P<0.001)。Western blot法进一步检测了PI3K/HIF1-α信号通路关键分子的表达水平,结果显示:DR组中PI3K、p-PI3K、HIF1-α蛋白表达水平较NC组升高(P<0.001);DR+C组中PI3K、p-PI3K、HIF1-α蛋白表达较DR组降低(P<0.001)。见图5。

图5 3组大鼠视网膜组织JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白分布情况A:JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF等蛋白的蛋白实验结果;B～F:分别为JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF的蛋白实验结果直方图;a:NC组;b:DR组;c:DR+C组;与NC组比较:***P<0.001;与DR+C组比较:###P<0.001

2.6 3组HUVEC细胞中JAML、VEGF表达水平及PI3K/HIF1-α信号通路的分子表达情况Western blot法检测HUVEC细胞中JAML和VEGF的蛋白表达水平,结果显示:HG组细胞中JAML和VEGF的表达水平高于NG组(P<0.05);HG+C组JAML、VEGF蛋白水平低于HG组(P<0.05)。Western blot法进一步检测PI3K/HIF1-α信号通路的分子表达水平:HG组细胞P-PI3K、HIF1-α的分子表达水平高于NG组(P<0.05)。HG+C组P-PI3K、HIF1-α蛋白水平低于HG组;3组HUVEC细胞中PI3K表达水平差异无统计学意义。见图6。

图6 3组HUVEC细胞JAML、P-PI3K、PI3K、HIF1-α、VEGF蛋白表达水平

3 讨论

DR是糖尿病引起的视网膜微血管的严重并发症。研究[3]表明,塞来昔布能降低视网膜中炎症因子水平,延缓DR的发生,但具体的分子机制尚不清楚。基于塞来昔布可延缓DR进展的重要作用,本研究旨在探讨其在DR视网膜炎症反应中的作用机制。本研究结果显示:DR大鼠经塞来昔布灌胃后视网膜中的IL-10、VCAM-1、HIF1-α、VEGF蛋白的表达降低;体外高糖诱导后的HUVEC细胞中证实,塞来昔布可降低高糖环境下内皮细胞HIF1-α、VEGF蛋白的表达。以上结果表明,塞来昔布可以减轻DR视网膜组织的炎症发应,降低VEGF的水平从而延缓DR的发生。

JAML是连接黏附分子(JAMs)家族成员,可促进白细胞在内皮细胞的黏附,破坏血管屏障功能,导致炎症的发生[6]。最近研究[7]表明,当细胞受到损伤刺激后,JAML的表达增加从而影响创伤修复。Fu et al[4]在糖尿病肾病的研究中发现JAML参与足细胞脂质代谢的稳态调控。糖尿病肾病与DR均是糖尿病导致的微血管病变,两者在发病的过程中有相似的病理特征。因此,本研究检测JAML是否参与塞来昔布减轻DR的作用机制。研究结果也显示高糖刺激下HUVEC细胞以及STZ诱导DR大鼠视网膜组织中JAML表达水平上调,其表达水平与炎症因子IL-10、VCAM-1等相关。塞来昔布干预后,JAML在DR大鼠视网膜和DR细胞模型中表达下降。这些结果显示,塞来昔布降低了JAML的表达,减轻了DR视网膜组织和高糖诱导的HUVEC细胞的炎症反应。研究表明,JAML蛋白位于内皮细胞的细胞膜,其胞内结构所具有的蛋白序列能够聚集PI3K,从而将外界的信号传递到细胞内进而介导细胞内下游分子的表达。JAML胞内段具有的PI3K聚集序列可以激活细胞的HIF1-α信号通路[8-10];并且有研究[11]表明,抑制HIF1-α的活化可以上调HUVEC细胞中VEGF的表达水平。基于以上的研究成果,本研究进一步探讨了JAML参与DR发生的信号通路。结果显示,DR大鼠视网膜PI3K、P-PI3K、HIF1-α的表达增高。塞来昔布干预后,DR大鼠视网膜PI3K、P-PI3K、HIF1-α蛋白表达下降。因此,塞来昔布可以减轻DR发生,其机制可能与JAML介导的 PI3K/HIF1-α信号通路有关。

本研究首先通过HE染色证实了DR大鼠视网膜新生血管形成,并通过Western blot检测出JAML、IL-10、VCAM-1在DR中表达升高;塞来昔布干预后,JAML表达降低,DR大鼠的视网膜病变缓解,炎症因子降低。本研究在HUVEC细胞和大鼠视网膜中进一步证实了JAML介导的PI3K/HIF1-α信号通路在DR中的作用。但该研究仍存在以下不足之处:首先,研究未干预JAML的表达来证实其调控炎症的作用机制;其次,研究中运用HE染色结果证明塞来昔布对DR发生的延缓作用,未进行视网膜造影来显示DR导致的视网膜血管的渗漏情况;再次,研究中DR大鼠的数量尽管符合统计的要求,但是需要更大的样本量来证实该研究结果;最后,研究未探究塞来昔布是如何调控JAML的表达,以及调控的机制。这些不足之处,将在以后的研究进一步完善。

综上所述,该研究通过体内和体外实验证实了塞来昔布具有延缓DR发生的作用。其机制可能是塞来昔布通过降低JAML的表达,从而介导PI3K/HIF1-α信号通路减少VEGF的生成以及发挥抗炎作用,延缓DR的发生。