载硅烷和BMP-2的多孔钛表面构建及其成骨活性评价

李 为,江崇英,张 雷,孙晓瑜,何 昕,洪 彪,程 楠,李向阳

种植义齿已经成为失牙患者的首选治疗方式,其成功的关键在于种植体与骨组织形成骨整合(osseointegration)[1]。目前种植体表面改性主要包括:① 形貌改性,通过物理化学手段构建表面超微结构以增加种植体-骨接触面积,促进成骨细胞黏附和分化而加速骨整合[2];② 表面化学改性,功能分子负载以加速表面矿化、促进骨整合[3];③ 生物分子改性,通过生物化学修饰将特定蛋白[4]或多肽[5]固定在种植体表面,诱导成骨细胞增殖分化以促进骨整合。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)作为骨基质中的高效骨诱导物质,已经通过涂覆和静电吸附等方法复合到材料表面,然而其材料结合较弱,容易脱落[6-7],所以寻找共价固定BMP-2的方法意义重大。该研究采用碱热处理在钛材表面获得富羟基的纳米孔结构,并进一步通过羟基与硅烷偶联剂键合反应赋予表面Si元素和用于接枝蛋白分子的氨基,最后通过戊二醛将BMP-2共价接枝在硅烷层的氨基上,实现载硅烷和BMP-2的多孔钛表面成功构建以改善钛表面的骨整合能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1材料 纯钛购自山西宝鸡有色金属有限公司; 丙酮、戊二醛购自上海国药集团化学试剂有限公司;二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷、Triton X-100、罗丹明123购自美国Sigma-Aldrich公司;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;胰酶、牛血清白蛋白、Ⅱ型胶原酶、重组人BMP-2、兔抗BMP-2抗体、生物素标记山羊抗兔IgG、Cy3标记链霉亲和素购自生工生物工程股份有限公司;DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.1.2仪器 扫描电子显微镜购自荷兰FEI公司;X射线光电子能谱仪(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)购自美国Perkin Elmer公司;接触角测试仪购自德国Dataphysics公司;酶标仪购自瑞士Tecan公司;荧光显微镜购自德国Leica公司。

1.2 样品制备

1.2.1碱热处理 将直径10 mm的钛片打磨抛光后,依次浸没于丙酮、无水乙醇、去离子水中分别超声清洗3次,每次10 min,取出晾干,标记为Ti;将Ti浸没于60 ℃的NaOH溶液(2.5 mol/L) 24 h,取出钛片并置于煮沸的去离子水30 min,去离子水超声清洗3次,每次10 min,取出吹干表面,标记为pTi。

1.2.2硅烷化处理 将pTi置于含1% (W/V) 二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中,摇床反应10 h,然后取出样品于120 ℃烘箱中2 h,取出后无水乙醇超声清洗2次,每次5 min,吹干表面,标记为pTi-S。

1.2.3BMP-2接枝 将pTi-S浸没于1%的戊二醛水溶液室温反应1 h,然后超声清洗去除未反应的戊二醛,将终浓度为0.5 μg/ml的重组人BMP-2工作液50 μl铺展在样品表面,室温反应24 h,去离子水漂洗后吹干,标记为pTi-S-B。

1.3 表面分析表征每组取1个样品利用XPS检测表面各元素百分含量;每组取1个样品通过场发射扫描电子显微镜观察样品表面形貌;每组取4个样品(每个样品选2个位置)利用水接触角测试仪(WCA)测量表面亲水性。每组取1个样品通过免疫荧光染色观察表面接枝的BMP-2,步骤如下:①1%的牛血清白蛋白溶液浸泡样品30 min以封闭非特异性吸附位点;② 取出并吹干表面,滴加20 μl的兔抗BMP-2抗体工作液(稀释100倍),恒温箱中37 ℃孵育2 h,PBS漂洗2次,每次2 min;③ 吸干表面液体,加入生物素标记山羊抗兔IgG工作液,继续37 ℃孵育30 min,PBS漂洗2次;④ 吹干表面液体,滴加Cy3标记链霉亲和素试剂,37 ℃孵育30 min,PBS漂洗2次,荧光观察,并通过Image J软件统计荧光强度。

1.4 细胞相容性评价

1.4.1成骨细胞的获取 取新生24 h的SPF级雄性SD大鼠经脱颈处死后分离的头盖骨,将其剪成2～5 mm2碎片,PBS清洗碎片后采用胰酶消化20 min,离心去上清液后加入Ⅱ型胶原酶消化20 min,收集消化液并采用1 200 r/min离心5 min,收集沉淀后DMEM培养基(20%胎牛血清)重悬并接种于培养皿中,5%CO2和37 ℃下培养2 d,然后改用10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养3 d后换液,待细胞达到80%融合时传代培养。

1.4.2材料的成骨细胞相容性评价 胰酶消化细胞后,采用DMEM培养基(10%胎牛血清)分散细胞且密度为1×104个/ml,每组取23个样品置于24孔板中,每孔加入1 ml细胞悬液,5%CO2和37 ℃下继续培养且隔天换液。在培养至1、3、5 d时,每组取出1个样品经戊二醛固定1 h后,罗丹明123染液染色15 min,PBS漂洗后再荧光观察;每组取出4个样品放入新孔,按照噻唑蓝法 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]评价材料对成骨细胞增殖的影响。培养至7 d和14 d时,每组取出4个样品,PBS清洗2次后吹干表面水分并滴加0.1%Triton X-100溶液50 μl裂解细胞,取30 μl用ALP试剂盒检测细胞ALP含量。取10 μl按照BCA法蛋白定量试剂盒检测蛋白含量。ALP活性最终以U/mg蛋白表示。

2 结果

2.1 样品表征

2.1.1表面形貌 扫描电子显微镜观察材料表面形貌变化,结果显示,相较于纯钛(Ti),碱热处理(pTi)后的钛表面出现多孔结构,孔径约为100 nm;硅烷化处理(pTi-S)和BMP-2接枝(pTi-S-B)表面的孔洞被填充、深度变浅,但纳米结构依然存在。见图1。

图1 各步处理表面的扫描电子显微镜照片 ×50 000A:Ti;B:pTi;C:pTi-S;D:pTi-S-B

2.1.2元素分析 X射线光电子能谱全谱检测分析了材料表面化学元素组成,结果如图2A所示,硅烷化处理的表面Ti元素的峰几乎消失,且出现了N和Si的峰,仅有硅烷试剂中存在大量的氨基和硅氧键;BMP-2接枝后,Ti2p峰完全消失,Si2P和Si2S峰减弱,不存在硅元素的BMP-2在表面接枝导致XPS检测深度范围内Ti消失并且Si含量降低。图2B、C分别是硅烷化处理表面和BMP-2接枝表面碳元素的高分辨结果,可以看到BMP-2固定后出现-C=O,硅烷试剂中不含C=O键,而BMP-2中含有大量的酰胺键。

图2 表面XPS结果A:各表面的XPS全谱图;B、C:硅烷化处理和BMP-2接枝表面碳1s (C1s)的高分辨谱

2.1.3亲水性 单因素方差分析结果显示,表面亲水性与表面结构及元素组成密切相关(F=140.14,P<0.01),纯钛、碱热处理、硅烷化处理和BMP-2接枝表面的水接触角分别为(58.3±7.0)°、(14.5±3.4)°、(92.7±8.3)°和(68.4±10.7)°,Turkey检验进行两两比较发现组间差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.1.4BMP-2荧光检测 特异性荧光染色可以观察BMP-2在表面的分布,如图3所示,硅烷化处理表面未观察到均匀分布的红色荧光,只观察到零星的红点,BMP-2接枝表面大部分区域分布着红色荧光;通过Image J软件测量照片中荧光强度数值,硅烷化处理、BMP-2接枝表面的荧光强度值分别为32 130 和6 850 320,后者是前者的213倍。

图3 表面BMP-2的免疫荧光检测A:pTi-S;B:pTi-S-B

2.2 成骨细胞相容性评价

2.2.1细胞黏附与增殖 材料表面成骨细胞相容性分别通过MTT实验和Rodamine123荧光染色来分析,MTT结果显示:培养第1天时硅烷化表面的细胞数量高于碱热处理组(P<0.05);第3天和第5天时,硅烷化表面与碱热处理表面的细胞数量差异无统计学意义;不同孵育时间BMP-2接枝组表面黏附细胞数量均显著多于其他两组,三组的方差分析显示差异有统计学意义(F=79.678、103.204、6.255,P<0.05)。见图4、5。

图4 各表面与细胞孵育第1、3、5天时黏附成骨细胞数量与pTi-S组比较:*P<0.05;与pTi组比较:#P<0.05

图5 各表面与细胞孵育第1、3、5天时黏附成骨细胞的荧光照片 ×100A、D、G:pTi孵育第1、3、5天时;B、E、H:pTi-S孵育第1、3、5天时;C、F、I:pTi-S-B孵育1、3、5天时

2.2.2细胞成骨能力 各表面所黏附成骨细胞的ALP活性见图6,培养第7天和第14天时,硅烷化表面ALP活性高于碱活化多孔钛(P<0.05),BMP-2接枝表面的ALP活性远高于其它,三组间差异有统计学意义(7 d:F=57.370,P<0.05;14 d:F=109.703,P<0.05)。

图6 各表面黏附的成骨细胞培养7 d和14 d时的ALP活性与pTi组比较:#P<0.05;与pTi-S组比较:*P<0.05

3 讨论

由于具有优异的机械性能、抗腐蚀性能、化学稳定性和生物惰性,钛及其合金被认为是牙科及骨科等领域的最佳植入金属材料,但也因生物惰性、高弹性模量等问题导致其骨整合缓慢或应力集中,进而愈合时间长,影响成功率[8]。骨整合指种植体与骨表面直接紧密结合,无任何插入组织,故成骨细胞越早黏附到种植体表面并执行成骨功能,骨整合效果越好。粗糙多孔表面降低材料的弹性模量,且提供更多的细胞“锚定”位点,有利于形成更牢固骨整合,且多孔结构可以在植入体和骨界面之间形成机械锁合,从而提高骨结合强度[9]。本研究采用碱热处理,获得了纳米级多孔表面;有研究[2,10]证明多孔结构中,纳米孔结构相比微米孔结构更利于成骨细胞的黏附和增殖。另外,多孔结构的表面积显著增加,可以增加硅烷偶联剂的连接位点,进而增加其固定量[11]。

硅作为人体必需的微量元素,对骨组织生长过程具有重要影响。有研究证明含硅涂层在机体内有效促进成骨细胞增殖、分化和钙矿化沉积作用[3]。本研究采用二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷,一端为甲氧基与表面的羟基连接[12],一端为氨基可以用于连接生物活性分子。本研究结果显示相较于碱热处理表面,硅烷化表面显著促进了成骨细胞黏附(培养1 d),但促成骨细胞增殖上未显示出与碱热处理表面的显著差异;其表面ALP表达量显著增加,证明其具有一定的促成骨分化能力[13]。

大量生物活性分子已经被证明可以有效提升骨修复的速度和质量。BMP家族是确定的促成骨因子,对骨原细胞的分化起决定性作用,也能影响其它细胞的转分化[14];其中BMP-2是BMP家族成员中作用最强的因子,可以促进ALP表达以增加成骨细胞矿化,也可以通过调控骨代谢以抑制骨吸收和促进骨形成。采用BMP-2直接或者通过其他载体局部应用可促进骨的形成已经过实验证实[15],但这些物理方式运载BMP-2到骨缺损部位,其在体内容易降解或扩散,无法充分发挥其功能。本研究利用戊二醛连接硅烷试剂上的氨基和BMP-2上的氨基,将BMP-2共价连接到纯钛表面,用以增加钛表面与成骨细胞的相容性。成骨细胞黏附和增殖结果和ALP含量检测结果均显示,该表面不但有利于成骨细胞黏附和增殖,而且可以诱导成骨细胞表达更多的ALP,促进成骨作用。