杨 琪,唐 颖,李午丽,陈乔尔,孙 麟,李 颂
活髓保存治疗(vital pulp therapy,VPT),即旨在保存和维持因广泛的龋坏、牙齿外伤、修复治疗或医源性原因而受损的牙髓组织[1]。次氯酸钠(NaClO)是VPT过程中常用的药物,已经证实其具备良好的抗菌和止血性能以及优异的组织溶解能力[2]。最近的一项对96例有轻微症状的不可复性牙髓炎患者进行的VPT试验中,发现使用2.5% NaClO冲洗显著减少了术后疼痛和治疗失败[3]。另有临床研究[4]也表明,与生理盐水相比,使用2.5%NaClO可以显著抵消牙髓炎症中高MMP9/TP值带来的炎症变化。这些研究足以提示,当NaClO冲洗应用于存在不可复性炎症和坏死感染的牙髓炎创面上时,可能会对其剩余牙髓组织的愈合产生有利影响,但在此方面并没有组织学证据。
该研究采用建立大鼠不可复性炎症牙髓模型并模拟临床牙髓部分切断术的方式,使用2.5%NaClO作为iRoot BP Plus盖髓前的冲洗剂,评估NaClO对炎症牙髓愈合和修复过程的影响,为临床不可复性牙髓炎保存活髓的治疗提供一定参考。
1.1 实验动物48只8周龄雄性SD大鼠(SPF级)购自安徽医科大学实验中心并饲养,体质量200 g±10 g,身体发育良好,恒牙列完整,口腔卫生良好,无龋齿及其他牙体牙周疾病。
1.2 主要试剂与仪器移动式牙科治疗机(型号:BD-402)购自广州超盛医疗器械有限公司;高速涡轮手机(型号:Pana-Max2 M4)购自日本NSK公司;DG16探针(型号0710-6D1)购自意大利ASA公司;牙科光敏刀(型号:008-0118)购自上海伟荣医疗器械有限公司;根管冲洗针头(型号:ORN-30G-22-3-B-M-S)购自河南佩朗医疗器械有限公司;球钻(型号:BR-49;BR-45)购自日本MANI公司;NaClO消毒液(货号:190901)购自武汉朗力生物有限公司;生理盐水(货号:L139053009)购自四川科伦药业股份有限公司;iRoot BP Plus(型号:IRBPP 4610 J3)购自加拿大Innovative Bioceramix Inc公司;玻璃离子水门汀(型号:Ketac Molar Easymix)购自美国3M公司。
1.3部分不可复性牙髓炎炎症模型[5]建立选取24只大鼠,其中20只大鼠称重后用2%戊巴比妥钠按50 mg/kg计量予以腹腔注射麻醉,取仰卧位固定于手术台上,0.5%碘伏消毒口腔及周围组织,用高速涡轮手机携BR-49号球钻在水冷却的条件下于双侧上颌第一磨牙的咬合面中央窝处间断钻磨,直至窝洞底部透粉红,随后换用 DG16 探针稍加压力穿髓,穿髓孔的直径约为0.35 mm,可见轻微出血点即为穿髓成功的标志。保持髓腔开放,根据牙髓暴露时间不同随机分为5组,即开放6、12、24、48、72 h组,每组4只。剩余4只不做处理作为对照组。术后采集标本,组织切片HE染色显示:开放24 h组牙髓组织均表现为轻度至中度的炎性病变以及小部分冠髓的坏死,根髓可见部分血管扩张充血(图1)。因此选择牙髓开放24 h模型作为此次实验所需的部分不可复性牙髓炎炎症模型。
图1 预实验HE染色显示髓腔暴露24 h牙髓组织出现部分不可复性牙髓炎组织学表现A:完整牙髓 ×50;B:开髓孔周围 ×200
1.4 实验动物模型建立另选取24只大鼠,随机分为2组,即2.5%NaClO冲洗(NaClO)组和生理盐水冲洗(NS)组,每组12只,以双侧上颌第一磨牙为实验牙。采用上述步骤髓腔暴露24 h后,大鼠再次被麻醉,0.5% 碘伏消毒口内及口周组织,用高速涡轮手机携BR-45号球钻在水喷雾冷却下高速切除表面感染坏死的牙髓并制备窝洞,大小为深度(1.0±0.1)mm,近远中宽度(1.2±0.1)mm,颊舌宽度(1.0±0.1)mm,每次备洞使用一个新钻头。随后NaClO组和NS组分别用2.5%NaClO溶液和生理盐水冲洗30 s,再用分别浸泡其中的无菌棉球固定3 min(所有标本均可达到止血),然后使用iRoot BP Plus盖髓,玻璃离子水门汀严密充填。适当调低对颌磨牙,整个实验过程严格按照无菌操作标准进行,均由同一名经验丰富的主治医师独立完成以上操作。
1.5 实验标本的制备分别于术后第1、7、28天每组随机取样4只,采用心脏灌注固定处死大鼠,迅速分离出含有双侧上颌第一磨牙的上颌骨并立即置于4%多聚甲醛中体外固定48 h。将固定好的标本放入10%的EDTA( pH=7.4) 溶液中,25 ℃恒温下脱钙4~5周,流水冲洗12 h,经脱水、透明、浸蜡处理,常规石蜡包埋,沿平行于牙体长轴方向做近远中向连续切片,厚度为4 μm,用于HE染色。
1.6 组织病理结果及分析光学显微镜下观察大鼠牙髓组织切片,采用组织学评分标准[6](表1),评估包括炎症细胞反应、组织破坏程度、修复性牙本质形成三种组织学特征并计分。
表1 牙髓组织学评分标准
1.7 统计学处理采用SPSS 26.0软件进行数据分析。用Shapiro-Wilk检验分析不服从正态分布数据。等级资料数据以频数表示。采用 Mann-WhitneyU检验对两实验组的牙髓组织炎症反应、组织破坏及牙本质桥形成程度评分进行统计分析,按α=0.05水准,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 各实验组组织病理学表现
2.1.1术后第1天 NaClO组所有样本牙(8例)髓腔开孔处部分牙髓组织缺失,可见少量或轻度炎性细胞浸润,周围成牙本质细胞排列紊乱,血管扩张充血,根髓组织形态基本正常(图2A);3例出现创面周围成牙本质细胞空泡性变,8例样本均未见修复性牙本质形成。NS组8例样本均表现为髓腔开孔处周围伴有少量炎症细胞或轻度的炎性浸润(图2B),血管增生扩张,成牙本质细胞层排列紊乱,根髓组织形态正常;其中5例样本可见创面下部分牙髓组织变性,所有样本均无修复性牙本质形成。
图2 术后第1天HE染色组织学表现A:NaClO组;B:NS组;1:×20;2:×50;3:×200
2.1.2术后第7天 NaClO组只有1例表现为重度炎症,根髓出现牙髓坏死。其余样本表现为少量散在炎症细胞或轻中度的炎性细胞浸润,较深的牙髓组织形态基本正常,伴有扩张充血(图3)。其中5例样本有不同程度的硬组织沉积。NS组有3例表现为中度炎性细胞浸润(1例髓腔内脓肿形成),炎性浸润达根管中上端1/3, 血管扩张明显;有2例出现了部分根髓的坏死,2例硬组织沉积形成。见表2。
表2 牙髓炎症反应、组织破坏程度及修复性牙本质形成情况统计表
图3 术后第7天HE染色组织学表现A:NaClO组;B:NS组;1:完整牙髓 ×20;2:冠髓 ×50;3:根髓 ×200
2.1.3术后第28天 NaClO组中6例样本表现为开髓口下方存在局限性的牙髓坏死区和少量或轻度炎性浸润,剩余2例伴有根髓的炎症和坏死。一半样本(4例)根髓有不同程度的牙髓组织变性。所有样本均有不同程度的硬化桥形成。其中4例形成了厚而均匀的修复性牙本质延续至根端(图4A)。NS组有2例出现了中重度的炎症反应和根髓的坏死,其余6例有少量或轻度炎性浸润,伴有血管增生扩张。3例样本表现为根髓组织纤维样变,所有样本均有不同程度的修复性牙本质形成,一直延伸至根髓(图4B)。
图4 术后第28天HE染色组织学表现A:NaClO组;B:NS组;1:完整牙髓×20;2:冠髓×50;3:根髓×200
2.2 各实验组炎症反应、组织破坏程度及修复性牙本质形成情况分析与统计结果根据上述的炎症反应、组织破坏程度及修复性牙本质形成情况的分级标准,对不同时间点各实验组进行评分、整理、分析如下(表2)。统计结果显示,NaClO组和NS组的牙髓炎症反应、组织破坏程度和修复性牙本质形成分别在术后第1、7、28天差异无统计学意义。表明两种冲洗剂表现出相似的作用。而术后时间对炎症和组织的影响差异也无统计学意义。但与NS组不同的是,NaClO组在第7天更早更多地形成了修复性牙本质,与第1天相比差异有统计学意义(P<0.05)。
临床上,牙髓疾病的诊断主要是依据患者的主观症状、客观的临床检查和放射学结果,而不是组织学结果。然而,这些临床诊断结果并不能准确反映牙髓组织的真实状态。即使有临床研究显示不可复性牙髓炎的牙齿采取VPT有较好的疗效,也不代表组织学成功,因为其也可能在没有临床症状和放射学证据的情况下发生治疗失败的结果,短期的成功率并不能说明治疗成功。因此,不可复性牙髓炎的活髓保存治疗仍然需要更多的组织学研究。本研究采用了动物炎症牙髓模型,模拟临床治疗程序,首次通过组织学观察,直观了解炎症牙髓经牙髓切断保存活髓治疗后其生物学反应和愈合潜力,为临床治疗判断预后提供参考。
本研究表明使用NaClO和生理盐水两种冲洗剂的牙髓在术后第1、7、28天表现出近似的炎症反应和牙髓变性表现。Elias et al[7]曾通过组织学研究评估人类牙髓使用NaClO作为冲洗止血剂对直接盖髓反应的影响,结果表明NaClO并不会影响牙髓修复;Özgur et al[8]将2.5%NaClO和生理盐水随机分配,用于龋源性露髓的未成熟恒磨牙部分牙髓切断术中的伤口冲洗,结果显示,2.5%NaClO消毒效果与生理盐水无显著性差异。在本研究中,NaClO首次用于处理炎症牙髓创面,其表现与生理盐水组基本相似,提示使用NaClO冲洗并未干扰炎症牙髓的自我修复反应,这与前述在健康牙髓上的研究结果一致。本研究为临床操作中创面冲洗剂的选择提供更多参考。
本研究同时观察了炎症牙髓组织的愈合情况,结果显示,经活髓切断治疗28 d后,炎症牙髓并没有完全恢复健康,根髓仍然存在炎症表现,部分出现牙髓变性。此结果与Ricucci et al[9]报道的“愈合牙髓(healed pulp)”的组织学特征相吻合。其在对根髓牙本质复合体应对深龋或修复的组织学研究中将牙髓变化分为四类,分别为可逆的牙髓组织学变化、不可逆的牙髓组织学变化、正常完整的牙髓和愈合的牙髓。其中“愈合的牙髓”表现为牙髓没有明显的炎性细胞积聚,但与正常组织学检查结果存在偏差,即有散在的炎性细胞、血管扩张充血、牙髓纤维化和正常成牙本质细胞层的减少。同时本实验结果也与先前报道的人类恒牙活髓切断术后的根髓变化相似,贾瑞芝 等[10]曾发现经VPT的根髓组织可发生成牙本质细胞空泡性变、细胞减少、纤维增多等退行性表现。本研究结果提示,对于炎症牙髓采取活髓保存治疗时,虽然牙髓的活力可以通过部分切除坏死的牙髓来维持,但剩余牙髓组织可能仍存在程度不等的炎症表现和组织变性。
本研究表明NaClO组在更早时间更多地形成了修复性牙本质。推测其原因可能是因为NaClO能够溶解矿化的牙本质基质、释放生长因子,尤其是TGF-β[11]。研究[12]已经证明,TGF-β1和TGF-β3亚型能够刺激成牙本质细胞分泌细胞外基质,从而刺激三期牙本质沉积。而在此之前,Silva et al[13]也曾通过组织学研究比较生理盐水、NaClO和氯己定作为止血剂对氢氧化钙覆盖的人牙髓组织学反应的影响,其研究发现NaClO在90 d时比三种药物在7 d时表现出更多的三期牙本质。在术后第28天,本研究观察到两组所有样本均有不同程度的修复性牙本质形成,同时还观察到新形成的三期牙本质一直延续至根端,这与Minic et al[14]发现在VPT后愈合的牙齿的根管壁上存在的管状第三级牙本质结果一致,认为形成的这种修复组织类似于矿化的纤维疤痕组织,并不是真正的管状牙本质。
虽然NaClO溶液广泛应用于活髓保存治疗过程之中,但是其对炎症牙髓的保存治疗是否有效尚缺乏组织学实验证据。本研究首次采用动物不可复性炎症牙髓模型,通过组织学观察研究NaClO作为盖髓前冲洗是否对剩余牙髓组织的愈合产生影响。结果表明,2.5%NaClO和生理盐水作为iRoot BP Plus盖髓前冲洗剂表现出相似的作用,并未对炎症牙髓的愈合过程产生影响,该结果为临床操作中创面冲洗剂的选择提供了参考;研究结果也显示不可复性牙髓炎经保存活髓治疗后,根髓仍存在炎症表现和一定程度的组织学变性, 表明现有的活髓切断术对于不可复性牙髓炎的组织并不能使其完全恢复健康。