虎地肠溶胶囊对放射性肠炎的防护作用及其机制

马洪林,周梦丽,饶先玥,汪 浩,张明霞

放射性肠炎是盆腔肿瘤放射治疗中严重并发症之一,常表现为腹痛、腹泻、肠出血、肠梗阻等,严重时可出现肠穿孔危及生命[1]。一旦出现上述严重并发症,会导致放疗的中止,严重影响了患者的预后。目前临床缺乏有效的防治药物,但一些中药制剂表现一定疗效。中医学认为放射线属“火热毒邪”,放疗后邪毒侵袭致脾胃功能受损,水湿内生,肠道功能传导失常谓之泄泻[2]。石文君 等[3]研究表明放射治疗会引起火毒之邪,致脾胃功能减退,体内湿气增加,正气内虚加剧,外邪更旺,是以正气内虚为本,火毒侵袭为标。中医治疗主要为清热利湿,活血化瘀。虎地肠溶胶囊具有清热、利湿作用,可用于治疗非特异性溃疡性结肠炎等[4]。有研究[5]表明虎地肠溶胶囊在宫颈癌放疗中使用可延缓放射性肠炎的发生,但具体机制不明。此次实验以大鼠小肠隐窝细胞(IEC-6细胞)为研究对象,探讨虎地肠溶胶囊放射性肠炎防治方面的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料大鼠IEC-6细胞购自上海富衡生物科技有限公司。DMEM高糖培养基、青链霉素双抗溶液购自美国Hyclone公司;澳洲胎牛血清购自美国 Gibco 公司;虎地肠溶胶囊购自安徽九方制药有限公司(产品批号:190404);Anti-P21、Anti-P16购自英国Abcam公司;β-actin、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2, SOD2)、过氧化氢酶(catalase,CAT)抗体购自上海信裕生物工程有限公司;β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自上海碧云天生物技术公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海晅科生物科技有限公司。

1.2 IEC-6细胞培养IEC-6细胞用含有1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37.0 ℃、5%CO2的培养箱中,观察细胞密度至90%以上即可传代,选对数生长期的细胞进行实验。虎地肠溶胶囊粉剂加入95%乙醇超声提取,旋转蒸发提纯药物后于真空泵中抽干,提取物溶于二甲基亚砜。因提取物为复方制剂,浓度计算方式为质量/体积。细胞分6组:对照组,未接受辐射及药物;模型组,仅接受最佳照射剂量辐射;虎地肠溶提取液组,将最佳浓度的提取液在照射前2 h加入培养基;照射剂量组,单纯接受不同剂量的电离辐射;提取液浓度A组,单纯将不同浓度提取液加入细胞培养基,不接受辐射;提取液浓度B组,将不同浓度的提取液在照射前2 h加入培养基。将12.5、25、50、100、200 μg/ml浓度的提取液在照射前2 h加入培养基,测量在各浓度下细胞活力。筛选出安全浓度范围后,在(10、20、40、80 μg/ml)虎地肠溶提取液浓度下电离辐射后的细胞活力,选取最佳药物浓度。

1.3 细胞克隆形成实验对照组和照射剂量组细胞,消化并稀释至110 个/ml时,接种于6孔板内,每孔600个细胞,置于5%CO2、37.0 ℃的培养箱中培养2周,当细胞集落出现时,加入纯甲醇固定15 min,去除固定液,加入0.1%结晶紫染色20 min,洗去染色液,在显微镜下统计细胞克隆数。

1.4 细胞活力检测细胞悬液按4 000个/孔细胞数接种在96孔板上,细胞贴壁后,加入不同浓度的虎地肠溶提取液培养24 h。每孔加10 μl CCK-8溶液,放入培养箱内1 h,450 nm波长处测吸光度。

1.5 ROS检测对照组、模型组及虎地肠溶提取液组细胞照射后6 h检测ROS。将DCFH-DA按1 ∶1 000 比例配到无血清培养基中,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、离心,加入DCFH-DA每组1 ml,放入培养箱内25 min,无血清DMEM培养基和PBS洗涤,使用荧光显微镜观察。

1.6 细胞衰老检测6孔板内各组细胞辐射后48 h进行细胞衰老检测。去除培养液,PBS洗涤2次,加入1 ml β-Gal染色固定液,室温固定10 min,吸去固定液,PBS洗涤3次。吸除PBS,加1 ml染色工作液。37 ℃孵育过夜,需在无二氧化碳环境下孵育。普通光学显微镜下观察。

1.7 细胞凋亡检测辐射后24 h收集细胞,常规消化处理,取1×105～5×105消化后的细胞混悬液离心,4 ℃预冷PBS洗涤1次,离心弃上清液后,加入100 μl缓冲液(稀释的1×Binding Buffer)重悬细胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI并混匀。避光25 ℃下孵育15 min,再加400 μl缓冲液上机检测。

1.8 Western blot法测定蛋白表达将照射后24 h的各组细胞,冰上裂解并提取总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度。经SDS-PAGE凝胶电泳分离,转移蛋白至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h,加入一抗稀释液摇床4 ℃过夜。TBST洗膜,加入二抗稀释液室温摇床1 h,TBST洗膜后通过ECL反应,胶片曝光成像,Quantity One 软件分析灰度值。

2 结果

2.1 辐射对细胞增殖的影响在4～10 Gy剂量辐射后细胞克隆团数低于对照组(P<0.001),随着辐射剂量增加,克隆团数量减少(P<0.001),见表1和图1。

图1 对照组及照射剂量组电离辐射后细胞克隆团数量 ×200A:对照组;B～F:辐射剂量为2、4、6、8、10 Gy;与对照组比较:***P<0.001

表1 电离辐射对细胞增殖的影响

2.2 虎地肠溶提取液对细胞活力影响CCK-8法进行吸光度值检测,虎地肠溶组浓度为100、200 μg/ml时与对照组比较细胞吸光度值及存活率下降(P<0.001),其余浓度下与对照组比较差异无统计学意义,见表2和图2。

图2 虎地肠溶提取液对细胞活力影响A:对照组;B～F:提取液浓度分别为12.5、25、50、100、200 μg/ml;与对照组比较:***P<0.001

表2 虎地肠溶提取液对细胞活力影响

2.3 虎地肠溶提取液对辐射后细胞的活力影响模型组和10、20 μg/ml浓度的虎地肠溶提取液组细胞吸光度值及存活率低于对照组(P<0.001)。而40、80 μg/ml的虎地肠溶组细胞吸光度值及存活率高于模型组(P<0.001),见表3和图3。

表3 虎地肠溶提取液对辐射后细胞的活力影响

2.4 各组之间DCFH-DA荧光强度、β-Gal阳性率及细胞凋亡率比较与对照组相比,模型组的DCFH-DA荧光强度、β-Gal阳性率及细胞凋亡率升高(P<0.05),与模型组比较,虎地肠溶提取液组DCFH-DA荧光强度、β-Gal阳性率及细胞凋亡率下降(P<0.05),见图4～6。

图4 3组IEC-6细胞内ROS变化 ×200A:对照组;B:模型组;C:虎地肠溶提取液组

图5 3 组IEC-6细胞β-Gal染色结果 ×200A:对照组;B:模型组;C:虎地肠溶提取液组;β-Gal阳性染色呈青绿色

图6 流式细胞术检测各组细胞凋亡水平A:对照组;B:模型组;C:虎地肠溶提取液组

2.5 虎地肠溶提取液的干预对P16、P21、CAT、SOD2表达影响与模型组比较,虎地肠溶组和对照组细胞SOD2、CAT的蛋白表达升高(P<0.05),P16、P21蛋白的表达降低(P<0.05),见图7。

图7 Western blot 检测各蛋白表达情况A:Western blot检测各组目的蛋白的表达;B:SOD2蛋白相对表达量;C:CAT蛋白相对表达量; D:P16蛋白相对表达量; E:P21蛋白相对表达量;a:对照组; b:模型组;c:虎地肠溶提取液组;与对照组比较:*P<0.05;与模型组比较:#P<0.05

3 讨论

急性放射性肠炎的发生主要是肠黏膜上具有快速增殖特性的隐窝上皮细胞有丝分裂受到抑制,肠道黏膜的更新能力丧失,导致细胞的衰老、凋亡的发生[6]。肠上皮细胞的更新主要是隐窝中的肠干细胞维持,隐窝上皮细胞在放射性肠损伤中占重要地位,IEC-6细胞分离自大鼠小肠隐窝上皮细胞,能更好地模拟放射性肠炎的特性。结合辐射后的细胞存活率,考虑细胞数目过少可能影响实验结果,选择6 Gy作为辐射剂量。

电离辐射可以促进细胞氧化应激,通过影响脂质、膜、蛋白质和DNA导致结构和功能细胞变化,诱导细胞凋亡并引发炎症反应[7-9]。DCFH-DA荧光探针可以检测出细胞内ROS水平,实验显示虎地肠溶提取液可以抑制辐射引起的ROS水平升高。这种抑制作用是否与抗氧化能力增加有关,我们可以根据一些抗氧化指标来判断。SOD2通过清除氧自由基促进了抗氧化、抗凋亡等保护机制[10]。CAT 也有抗氧化、抗凋亡作用。本实验Western blot结果显示虎地肠溶组SOD2及CAT指标较模型组升高,说明虎地肠溶提取液通过提高细胞抗氧化能力,达到降低ROS水平及氧化应激反应的作用。

电离辐射可以直接损伤细胞DNA,产生大量ROS导致氧化应激并诱导衰老[11]。衰老细胞的生理功能和应激反应下降,对细胞损伤后的自我修复能力下降。β-Gal作为一种细胞内溶酶体酶,被认为是衰老细胞的特异性标志物之一[12]。p16和p21是衰老细胞的特异性基因,其中p21作为p53的下游基因参与衰老调控,并通过抑制细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6、CDK2调控细胞周期[13-14]。研究[15]结果显示细胞经电离辐射后β-Gal活性增加,p16、p21基因表达增加。本研究可以通过上述指标观察细胞的衰老情况。根据Western blot检测蛋白和β-Gal染色结果,提示虎地肠溶提取液减轻了辐射损伤后的细胞衰老。

通过本次实验结果可以得出结论,虎地肠溶提取液可以通过抑制细胞内活性氧的产生,减少氧化应激,来减轻电离辐射诱导的细胞衰老及凋亡。然而电离诱导细胞损伤的机制是复杂的,作用靶点也是多样的,既可以通过直接损伤传到黏膜屏障,也可以调控细胞衰老和凋亡的信号通路造成细胞的损伤。本实验研究结果仅得出氧化应激与电离辐射损伤相关性,而氧化应激造成细胞损伤的信号通路仍不明确,对于放射性肠炎的复杂致病机制来说有一定局限性,并且虎地肠溶胶囊作为一种复方中药制剂,其结构及组成也是复杂的,在放射性肠炎治疗中发挥主要作用的成分未能明确,因此其具体作用机制仍需进一步探讨。