miR-200b对小鼠矽肺纤维化的抑制作用

袁翠芳,李 航,熊余璐,郭梓烨,王 颿,陈茹茹,郝小惠,2,刘和亮,2,郭灵丽,2

矽肺是一种由于吸入游离二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)粉尘而引起的慢性间质性肺病,其主要特征包括慢性炎症、肺部炎性肉芽肿、迟发性肺间质纤维化和进行性呼吸功能障碍[1]。矽肺是我国最严重的职业病,国家卫生健康委员会发布的文件显示,2020年我国新增职业性尘肺病患者14 367例,死亡6 668例[2]。矽肺不仅威胁着工人的身心健康,还给国家带来了巨大的经济负担,是许多国家迫切需要解决的严重公共卫生问题。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一种长度为19～22个核苷酸的内源性非编码小RNA,微小RNA-200b(microRNA-200b,miR-200b)是miR-200家族中的一员[3],有研究[4-6]报道miR-200b在肾脏纤维化、口腔黏膜纤维化和心脏纤维化等多种纤维化疾病中发挥重要作用。然而,miR-200b在矽肺纤维化中的作用及机制尚不清楚。该研究通过构建小鼠矽肺纤维化模型并给予miR-200b模拟物(miR-200b agomir)干预,通过肺功能检测、肺组织病理学检测等手段,以期明确miR-200b在矽肺纤维化发病过程中的可能作用,为寻找有效治疗矽肺纤维化的靶点提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 24只SPF级雄性C57BL/6小鼠(6～8周龄,体质量16～18 g)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。实验小鼠饲养在温度(23℃±2℃)和湿度(60%±10%)可控的房间内,光照-黑暗交替循环12 h,可以自由进食和饮水。所有实验操作均得到了华北理工大学实验动物伦理委员会批准(编号:SQ2022122)。

1.1.2主要仪器和试剂 SiO2(美国Sigma公司),其中99%粒径为0.5～10 μm,使用前充分研磨并于180 ℃烘烤2 h,脱水除去内毒素;miR-200b agomir(广州市锐博生物科技有限公司);转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);甲醛溶液(天津市津东天正精细化学试剂厂);伊红和苏木精染液(珠海贝索生物技术有限公司);Masson染液试剂盒(北京雷根生物科技有限公司)。Fine Pointe Whole Body Plethysmography全身体积描记系统(美国Buxco公司);酶标仪(美国Molecular Device公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与处理 将C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组、SiO2组、SiO2+agomir-NC组和SiO2+miR-200b agomir组,每组6只。SiO2组小鼠予以一次性气管滴注50 μl生理盐水溶解的SiO2(5 mg/只)悬液;SiO2+agomir-NC组、SiO2+miR-200b agomir组气管分别注入50 μl含5 nmol agomir的阴性对照(agomir-NC)、miR-200b agomir 的SiO2悬液,造模第7天再次气道滴注2.5 nmol agomir-NC、miR-200b agomir 干预;对照组滴注等量生理盐水。造模第14天测定小鼠肺功能后将其处死。

1.2.2小鼠支气管肺泡灌洗 使用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠后,将小鼠仰卧位固定于手术板上,沿颈正中线处剪开约1 cm的小口,钝性分离气管周围肌肉以暴露气管,在气管插管的情况下,采用止血钳将小鼠右肺结扎,使用1.5 ml(0.5 ml×3次)无菌PBS溶液缓慢灌洗左肺,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。将得到的BALF在4 ℃以1 000 r/min离心6 min,吸出上清液并储存在-80 ℃用于总蛋白浓度测定和ELISA分析。加入0.1 ml PBS重悬剩余的细胞沉淀,随后使用血细胞计数板计算白细胞总数。

1.2.3小鼠肺组织病理学检查 在室温下将小鼠右下部肺组织置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h后流水过夜,然后将肺组织依次放入60%、70%、80%、90%和无水乙醇中各2 h进行脱水,随后放入醇苯混合液、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各20 min进行透明,接着将肺组织在60 ℃下浸入蜡液中6 h以上,最后将标本包埋于石蜡中并切成5 μm的切片。进行HE和Masson染色,染色操作均按试剂盒说明书进行,最后使用光学显微镜观察拍照。

1.2.4小鼠BALF中TGF-β1含量的测定 采用酶联免疫双抗夹心法测定上述BALF中TGF-β1的水平,实验操作均按照试剂盒说明书进行,根据样本在波长450 nm处吸光度值以及标准曲线,计算样品中TGF-β1的浓度。

2 结果

2.1 HE染色结果如图1所示,与对照组相比,SiO2组和SiO2+agomir-NC组小鼠肺泡壁增厚,肺组织存在炎症细胞浸润和少量细胞结节,而SiO2+miR-200b agomir组小鼠肺组织中炎症细胞浸润程度减轻、细胞结节数量减少。

图1 小鼠肺组织HE染色结果×200A:对照组;B:SiO2组;C:SiO2+agomir-NC组;D:SiO2+miR-200b agomir组

2.2 Masson染色结果Masson染色结果(图2)显示,与对照组相比,SiO2组和SiO2+agomir-NC组小鼠肺泡间隔和细支气管区可以看到胶原沉积,而SiO2+miR-200b agomir组小鼠肺间质胶原沉积显著减少。

2.3 小鼠肺功能检测结果如表1所示,与对照组比较,SiO2组和SiO2+agomir-NC组小鼠呼吸频率(frequency,f)加快、呼吸暂停(pause,PAU)次数增加(P<0.05),呼气峰值时间比率(ratio rate of achieving peak expiatory flow,Rpef)降低(P<0.05)。与SiO2组相比,SiO2+miR-200b agomir组小鼠f和PAU减少,Rpef升高(P<0.05)。

表1 各组小鼠肺功能检测结果

2.4 小鼠BALF中总蛋白浓度、白细胞总数和TGF-β1的含量BALF中总蛋白浓度的高低和白细胞数量的多少可以反映肺部炎症的水平,而TGF-β1作为一个经典的促纤维化细胞因子与肺部的纤维化水平密切相关。由表2可知,与对照组比较,SiO2组和SiO2+agomir-NC组小鼠BALF中总蛋白浓度、白细胞总数和TGF-β1的含量均增加(P<0.05),而SiO2+miR-200b agomir组小鼠上述3项指标的含量均低于SiO2组(P<0.05)。

表2 各组小鼠BALF中总蛋白浓度、白细胞总数和TGF-β1含量的比较

3 讨论

矽肺是一种由于吸入SiO2粉尘而引起的严重的职业性呼吸系统疾病,以肺部炎症和纤维化为主要特征。我国是矽肺患者最多的国家,每年因矽肺造成的直接经济损失超过80亿元人民币[7]。然而,矽肺的发病机制目前尚不明确,临床上缺乏有效的治疗药物。因此,研究矽肺的发病机制,探索新的防治方法具有重要意义。miRNAs是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,它可以与靶基因mRNA序列的3′UTR区域互补结合,抑制靶基因的翻译或降解其信使RNA[8]。已有研究[9-10]证实多种miRNAs参与了矽肺纤维化,然而,有关miR-200b在矽肺纤维化中的作用及机制还不清楚。

本研究通过一次性气管滴注SiO2颗粒建立小鼠矽肺纤维化模型,病理染色结果显示,SiO2组和SiO2+agomir-NC组小鼠肺组织均存在明显的炎症细胞浸润和胶原的沉积,而经miR-200b agomir干预可以缓解SiO2引起的病理变化。BALF中总蛋白浓度和白细胞总数是反映肺部炎症的重要指标,此研究表明miR-200b agomir干预可以降低以上指标的变化。上述结果均说明miR-200b agomir可以一定程度减轻小鼠肺部炎症反应,抑制肺部纤维化的发生发展。已有研究[11]报道吸入SiO2可诱导大鼠双期肺反应,表明暴露于SiO2的大鼠存在“炎症”和“纤维化”阶段。在本研究中,SiO2组小鼠肺组织存在明显的炎症细胞浸润而无明显的矽结节,可能是暴露于SiO214 d时小鼠仍处于炎症阶段,暴露时间较短,不足以形成明显的矽结节,在后续的实验中应适当延长SiO2暴露时间。

随着肺组织纤维化病情的发展,会引发气体交换功能障碍和肺功能损伤[12]。小鼠肺功能检测结果发现,SiO2+miR-200b agomir组小鼠f、PAU和Rpef较SiO2组和SiO2+agomir-NC组均得到明显改善。另外,矽肺是一种复杂的慢性炎症过程,涉及多种细胞、细胞因子和多种介质。肺泡巨噬细胞是矽肺的主要免疫细胞,在矽肺的发生发展中起着至关重要的作用。多项研究[13]表明,肺泡巨噬细胞可以通过清道夫受体以电荷依赖的方式识别并吞噬SiO2颗粒,从而增加炎性和纤维化介质的释放。在这些与纤维化相关的细胞因子中,TGF-β1起着关键作用,被认为是矽肺的起点。越来越多的证据[14]表明,TGF-β1作为一种强大的促纤维化细胞因子,它可以通过诱导成纤维细胞合成细胞外基质,包括胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等。本研究中,SiO2组和SiO2+agomir-NC组小鼠BALF中TGF-β1的表达水平升高,但是给予miR-200b agomir干预后TGF-β1的分泌降低,这提示SiO2暴露可以促进呼吸道和肺组织免疫细胞合成和释放TGF-β1,而当使用miR-200b agomir干预后,可以有效阻止该因子的合成,进而缓解矽肺纤维化。

综上所述,该研究表明miR-200b可以有效减缓矽肺小鼠肺功能的下降、抑制矽肺纤维化的发生发展,提示miR-200b可能是治疗矽肺纤维化的潜在靶点。该研究仅从靶向干预的角度阐述了miR-200b在实验性小鼠矽肺纤维化中的作用,然而其对矽肺进程的具体作用机制仍需进一步探讨。