响应面法优化双柏散中总黄酮的超声波萃取工艺

刘建清，林水森，谢志新，谢娜娜

（泉州医学高等专科学校 药学院，福建 泉州 362000）

双柏散是已故名老中医黄耀燊的经验方，处方由大黄、侧柏叶、黄柏、泽兰、薄荷组成，临床用于跌打损伤、红肿疼痛等症状治疗，因疗效可靠、安全性高被收录于《中医伤科学讲义》中[1-2]。

为提高双柏散使用方便性，近年，双柏散被研制成软膏剂、喷雾剂、巴布剂等新剂型，其中双柏散的提取是新剂型研发成功的关键，也是后续临床应用安全、有效的保障。目前关于双柏散提取，尤其是提取优化的文章报道较少。超声波萃取是利用超声波具有机械效应、空气效应和热效应等特点，提高萃取溶剂的扩散和渗透能力，从而促进目标成分提取的方法，具有无需高温、常压萃取、萃取率高等优点[3-6]。

本研究以总黄酮为指标，采用响应面法对双柏散超声波萃取工艺进行优化，探究双柏散最佳提取工艺，为后期双柏散新剂型的研究提供技术参数。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BSA623S精密电子天平[Satorius（北京）]；CN-LQC3001电子天平（昆山优科维特）；UV-2700型紫外分光光度计（岛津-苏州）； Scientz-250/500/1000c多功能恒温超声波萃取仪（新芝科技）；80-2电动离心机（常州国宇）。

1.2 试药

大黄（产地甘肃，批号：220102），侧柏叶（产地江苏，批号：220302），黄柏（产地四川，批号210602），泽兰（产地福建，批号220202），薄荷（产地江苏，批号220102），均购自铭远健康集团有限公司。芦丁对照品（源叶生物，批号：153-18-4），乙醇（西陇科学，批号：2109011）。

2 方法与结果

2.1 芦丁对照品储备液配制

精确称量芦丁对照品0.0323 g，置50 ml量瓶中，加70 %乙醇溶解定容，摇匀，即得0.646 mg/ml的对照品储备液。

2.2 线性与回归方程

精密量取对照品储备液（0.646 mg/ml）0.5，1，1.5，2，2.5 ml，分别置50 ml量瓶中，加70 %乙醇定容。采用直接测定法，于254 nm处分别测定各对照品溶液吸光度（A）。以芦丁浓度（mg/ml）为横坐标、A值为纵坐标绘制标准曲线，可得回归方程：Y=31.194X+0.00683，r=0.9997，表明芦丁对照品浓度在0.00646～0.0323 mg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.3 双柏散总黄酮提取及测定

按处方比例称取大黄、侧柏叶等混合，粉碎成粗粉后，按液料比20加入70 %乙醇，于40 ℃下超声20 min，经纱布过滤取药液于3000 r/min离心5 min，取上清0.5 ml加70 %乙醇定容至50 ml。按2.2项下方法进行测定。

2.4 单因素考察

影响超声波萃取工艺的因素较多，本试验通过前期考察及参考相关文献[7]，最终确定乙醇浓度、液料比、超声温度及超声提取功率4个因素进行超声波萃取单因素考察，具体考察条件见表1。

表1 单因素考察条件设计

2.4.1 不同浓度乙醇对总黄酮超声提取率的影响 结果见图1。

由图1可见，当乙醇浓度逐渐升高时，双柏散中总黄酮的提取率呈先增后减趋势。这可能是因为乙醇在低浓度时，随着浓度升高，对总黄酮类化合物的溶解度随之增加，但乙醇达到一定浓度后，乙醇溶液极性大小及溶解范围出现变化，总黄酮类化合物的溶出量下降；同时双柏散中的糅质、色素等杂质溶出增多，也干扰总黄酮的测定，进而影响双柏散的提取率。

2.4.2 液料比对双柏散中总黄酮提取率的影响 结果见图2。

由图2可知，在液料比10～25范围内，总黄酮提取率随着提取溶剂量的增加而提高。在液料比20～30范围内，总黄酮提取率升高趋势已不明显，当液料比为30时，总黄酮提取率甚至出现了下降趋势，这说明总黄酮的溶出扩散已达到平衡，增加溶剂量对总黄酮提取效果意义不大。

2.4.3 超声萃取温度对双柏散中总黄酮提取率的影响 结果见图3。

图3 超声萃取温度对双柏散中总黄酮提取率的影响

由图3可见，30～60 ℃范围内，随着超声温度的升高，总黄酮提取率随之升高。但随着温度进一步升高，超过60 ℃后，总黄酮提取率反而下降，这可能是因为当温度升高到一定程度后，双柏散中总黄酮类化合物被破坏，反而使提取率下降。

2.4.4 超声功率对双柏散中总黄酮提取率的影响 结果见图4。

图4 超声功率对双柏散中总黄酮提取率的影响

由图4可见，当超声功率较低时，如超声功率为540 W时，总黄酮的提取率为7.23 %，随着超声功率的提高，当超声功率为720，900，1080，1260 W时，总黄酮的提取率为8.3 %～8.7 %。这说明当超声功率达到720 W后，随着超声功率的提高，对于总黄酮的提取影响较小，最后将提取超声功率定为900 W。

2.5 响应面法优化超声波萃取工艺

2.5.1 试验设计及结果 根据单因素水平考察结果，选取对总黄酮提取率影响较大的因素，包括乙醇浓度、液料比、温度3个因素，以总黄酮提取率为指标，采用三因素三水平的试验设计，优化双柏散的超声萃取工艺，各因素水平见表2，响应面法结果见表3。

表2 三因素三水平响应曲面法试验设计表

表3 试验优化双柏散中总黄酮超声萃取试验设计及结果

2.5.2 线性拟合结果 用Design Expert 8.05软件对表3数据进行非线性方程拟合[8-9]，以提取率（Y）为因变量，各提取因素为自变量，可得Y=8.57-0.71A+0.27B+0.17C+0.02AB-0.35AC-0.07BC-1.22A2-0.082B2-0.21C2，该模型相对应P值<0.0001，可知该模型显著，预测好（失拟项P=0.7510＞0.05），变异系数（CV）=0.96 %，可知工艺稳定性好，可靠性高，具有一定的实践指导意义，见表4。

表4 方差分析结果

2.5.3 响应面优化结果 根据回归方程，做不同提取条件的响应面图，结果见图5。从图中可看出不同提取条件相互作用对总黄酮提取率的影响，其中乙醇浓度和温度的相互作用影响较为显著。

图5 不同因素相互作用对双柏散中总黄酮提取效果影响的响应面图

2.5.4 验证试验 以Design-Expert 8.05软件优化得总黄酮的超声萃取工艺为：乙醇浓度62.26 %，液料比24.77，超声温度54.29 ℃。为方便试验可操作性，进一步将超声萃取工艺确定为乙醇浓度62 %，液料比25，超声温度54 ℃，按该工艺进行3批双柏散超声萃取验证，结果显示提取率为8.80 %±0.13 %（RSD=1.45 %，n=3），与预测值的相对误差为2.13 %，提示模型预测较好。

3 讨论

现代研究表明黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、镇痛等作用，起到消肿止痛之功[10-12]。双柏散中的大黄、侧柏叶及泽兰均含有黄酮类化合物，因此本试验选择总黄酮为指标优化双柏散的超声萃取工艺。

超声波萃取工艺研究中，为保证试验准确性和平行性，在操作中应注意一些细节，减少组间人为差异，包括超声结束后应迅速过滤，防止双柏散继续在乙醇中浸润；超声过程中需用保鲜膜遮盖，防止乙醇在超声过程中挥发，影响总黄酮的测定。

本文在单因素考察基础上，通过响应面法优化双柏散中总黄酮的超声萃取工艺，最终确定超声波萃取条件为乙醇浓度62 %，液料比25，超声温度54 ℃，该工艺获得的总黄酮提取率平均约8.8 %，与软件预测结果接近，表明建立的响应面法模型可靠。