涂膜粉碎法制备原花青素缓释微粒的研究

王 皎，彭苑哲，普 青，王文苹,

（1. 云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500；2. 云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明 650500；3. 云南省南药可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500）

葡萄籽原花青素（PC）是由不同数量的儿茶素、表儿茶素单体聚合而成的多聚体，具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗辐射等药理作用；因结构中富含羟基，故抗氧化活性是维生素C的几十倍，是目前世界上公认的最有效的天然抗氧化剂，已在食品、药品和化妆品领域广泛应用[1-3]。但PC稳定性不佳，易受光照、温度、氧化剂等多重因素影响，且PC在胃肠道中不易吸收，口服生物利用度较低[4]，致使其应用受限。

乙基纤维素（ethyl cellulose，EC）已广泛用作药物载体，其不溶于水，但在乙醇等有机溶剂中溶解性较高。EC具有无毒无害、廉价易得、富含羟基、易被改性、可生物降解、可塑性强等优点，可形成机械性能良好的韧性薄膜[5]。EC薄膜具有良好的热稳定性，即使在低温下仍保有一定的柔韧性。此外，还可通过一些简单的方法将EC制备成密度更小、力学性能更好的多孔聚合物微粒，粒径多为微米级，在药物的保存、运输、释放过程中起隔绝污染和破坏的保护作用，同时控制药物释放速度以改善药效[6]。EC在人体胃部酸性环境中也无法溶解，口服后能通过肠道排出，对人体无毒副作用。

微粒是一种常见缓控释药物载体，其容纳范围广、释药行为可调，且能实现药物固态化和稳定化。其一般制法包括乳化-溶剂挥发、反溶剂沉淀、喷雾干燥或高压电纺丝工艺等，需特殊设备[7]；另有一种涂膜粉碎法，其操作简单、无需特殊设备和有机溶剂、物料利用率高，目前仅有少数报道涉及。因此本研究以EC为载体材料、PC为模型药物，采用涂膜粉碎法制备载药微粒，并初步考察工艺和药载比例对微粒形态、成型过程、载药量和包封率、相互作用、体外释放等的影响，为涂膜粉碎工艺的深入研究和推广利用提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BCE224-1CCN十万分之一电子天平（北京赛多利斯）；T6新世纪紫外分光光度计（北京普析）；Great20傅立叶变换红外光谱仪（天津中科瑞捷）；TGL-16.5M高速冷冻离心机（上海卢湘仪）；MVE067464-60046-S Phenom飞纳台式扫描电镜（Thermo Fisher scientific）；THZ-100恒温培养摇床（上海一恒）；SG250HP超声波清洗器（上海冠特）；EU-KI-20TF纯水机（南京欧铠）；针头式过滤器（常德比克曼）。

1.2 试剂

PC（天津尖峰，批号：002-1905036-10）；EC（江西阿尔法高科药业，批号：20220210）；4-二甲基氨基肉桂醛（DMAC，上海麦克林）；氢氧化钠，磷酸二氢钾（天津风船）；盐酸（云南杨林工业开发区汕滇药业）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 PC测定方法

用70 %乙醇配制0.5 mg/ml PC溶液。精密量取1.00 ml PC溶液，用70 %乙醇分别稀释4，5，6，8，10，18，40倍，分别取1 ml各浓度溶液和70 %乙醇空白溶液，加DMAC显色剂[8]3 ml，室温放置30 min，于644 nm处测定吸收值，以PC浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=6.4852C+0.0313，r2=0.9991。结果表明，PC在12.5～125 μg/ml浓度范围内线性关系良好。精密度试验RSD为0.39 %，重现性试验RSD为1.75 %，加样回收率在99.46 %～106.29 %范围内，RSD为3.24 %。

2.2 微粒的制备

采用涂膜粉碎法[9]：将PC、EC分别溶于80 %乙醇溶液中，按药载比PC:EC=1:5，2:3，2:1混匀；将混合液涂布于水平洁净玻璃板上，室温下自然挥干，将膜刮下研细过100目筛，即得微粒样品，分别记为PE15、PE23、PE21，密封，置阴凉干燥处保存。同法分别制备空白微粒（EC-MP）和药物微粒（PC-MP）作为对照。

2.3 微观形态

取少量上述样品以双面导电胶固定于样品台上，喷金处理后置于扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）下观察其形态。结果见图1。

图1 SEM下样品微观形态

由图1可知，PC原料呈皱缩粒子（图1A），个别为饱满球形、表面光滑，粒径约在10～25 µm范围内，大量粒子破裂、暴露出内部空心，壁厚约1～2 µm；经醇溶挥干再粉碎后，PC形态发生显著改变（图1B），呈50～80 µm的疏松类球形微粒，由1～2 µm球形或不规则粒子相互黏接、融合形成。

EC本身为不规则颗粒、粒径较大（60～70 µm），表面粗糙、密布孔道、结构疏松（图1C）；经处理后，自发转变为均匀细小的球形微粒，直径约0.7～2 µm、表面光滑，大量粒子密集排列、粘连成片（图1D）。

当药物与辅料混合处置后，不同PC:EC比例所得样品含大量球形粒子、聚集成块片状（图1E、F、G）；样品中EC含量越高，则微粒粒径较小且均匀度更佳，其中PE15粒径为2～3 µm，PE21粒径为3～10 µm；随着PC比例增大，逐渐出现一些不规则块状物，其断面略粗糙，推测可能是在溶剂挥发过程中发生了相分离，形成微粒的同时产生块状物。还可能是因EC具有黏性，使载药微粒在干燥过程中形成粘连结块，在一定程度上影响微粒粒径分布。

2.4 微粒形成过程的观测

取少量药物、载体或二者混合溶液，滴至洁净载玻片上，置光学显微镜下，观察溶剂挥发过程中体系的动态变化，并录制视频，结果见图2。

图2 PC、EC、PE21 挥发过程图（20×）

由图2可知，0 min时三者均有细小微粒浮动；PC在溶剂挥发过程中微粒沉积并逐渐聚集成片，形成药物富集区域，待溶剂挥干后PC聚集区更密集。溶剂挥发过程中EC无明显聚集，与0 min相比有明显的细小颗粒分散分布，2 min25 s时溶剂挥干，可看出溶剂挥干后有大量粒径约1 µm的细小颗粒析出，终点时颗粒大部分呈均匀分布，少部分堆积。PE21在0 min出现稀疏的细小颗粒，1 min时与EC 3 min时现象类似，有密集细小颗粒均匀分布；随着溶剂挥发，发生相分离现象，呈现颗粒状和界限分明的沟壑状，可能是在此过程中EC包裹PC形成颗粒，而未被包裹的PC则以另一种形式存在，出现药物富集区。溶剂挥干后大部分区域呈均匀分布。

2.5 载药量和包封率的测定

准确称取5 mg微粒样品，加70 %乙醇使其充分溶解并定容至10 ml，按2.1项下方法测定原花青素含量；按以下公式计算微粒的载药量和包封率，平行测定3次，结果见表1。

表1 PE微粒的载药量和包封率（n=3）

结果表明，PE微粒的包封率均较高，随着药物比例的增加，微粒载药量也在增加，但包封率先增后减。可能是因为EC具有黏性，使得载药微粒的载药量与包封率均较高。

2.6 傅立叶变换红外光谱（FT-IR）

采用105 ℃烘干5 h的溴化钾（KBr）混合研磨压片，扫描范围4000～400 cm-1，分辨率4.0 cm-1，扫描信号累加次数为16次；分别对PC、PC-MP、EC、EC-MP、PC与EC物理混合物（PE-PM）、PE15、PE23、PE21进行扫描，并绘制FT-IR谱图，结果见图3。

图3 FT-IR图谱

由图3可见，PC在3356 cm-1处为其分子结构中酚羟基由氢键作用引起的伸缩振动，1606，1519，1445 cm-1处是苯环骨架中C=C的伸缩振动吸收峰；1281，1152，1108，1060 cm-1对应的吸收峰为PC分子结构C环的C-O-C的伸缩振动；PC-MP与PC的红外吸收特征基本一致。EC在3477和2984 cm-1处的吸收峰由其分子中的-OH和-CH2伸缩振动产生，-CH3弯曲振动形成1380 cm-1处的峰。EC-MP相应位置的吸收峰均减弱。物理混合物的红外图谱基本为PC和EC的叠加。载药微粒的红外谱图基本一致且与原花青素谱图类似，表明载药微粒里的化合物主要以原花青素为主，苯环骨架C=C的伸缩振动吸收峰红移，载药微粒谱图在3416 cm-1处有吸收峰，这可能是因为原花青素与载体物质产生了分子间作用力，形成了氢键，-OH伸缩振动蓝移变为O-H伸缩振动产生的。

1606 cm-1处为PC的特征峰，在PE-PM图谱中的同一位置仍存在且强度增大，表明PC未被EC包裹并与其发生相互作用，与载药微粒相比，同一位置的峰仍存在但强度减弱，表明PC被EC包裹，且随PC的比例增加，1606 cm-1处的峰强度逐渐增大，表明有部分PC未被EC包裹，载药微粒可能会发生相分离现象。EC在3477，2984 cm-1处的吸收峰可为其特征峰，在PE-PM谱图中仍存在，但强度减弱，表明PC与EC物理混合时可能形成氢键，从而影响其强度。与载药微粒相比，同一位置的峰仍存在，但由于EC将PC包裹产生分子间作用力，使其强度更弱。

2.7 体外释放考察

分别精密称取一定量的PC-MP、PE21于5 ml离心管中，加入3 ml释放介质（pH 6.8磷酸盐缓冲液），离心管置于恒温培养摇床内（37±0.5 ℃，100 r/min），分别于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h高速（10 000 r/min）离心5 min后，取上清（2.7 ml），同时补充同温等量介质，经0.22 µm水系针头式微孔滤膜过滤，取续滤液 1 ml，按2.1项下方法测定PC含量，平行测定3次，据PC标准曲线计算浓度，根据以下计算累积释放量（Q）[10]，并以累积释放量对相应的时间作图，分别绘制体外释放曲线。

其中，V0为释放介质总体积；Vi为释放介质置换体积；Ci为在第i个时间点取样时释放介质中的药物浓度；m为微粒所载药物总质量；n为取样次数，结果见图4。

图4 原花青素缓释微粒累计释放曲线

由图4可知，两者在12 h时均已释放80 %，24 h释放较完全；PE21在0.5 h时释药略低于PCMP，此后均较高；PE21在12 h内的释放呈典型的缓释特征，而PC-MP在2 h内快速释放50 %之后，此后10 h内释药速率几乎恒定。

0.5 h之前PC-MP是直接释放，PE21因缓释材料EC的存在使得释放减慢，0.5 h之后PC-MP释药速率低于PE21。PE21的粒径为3～10 µm，PC-MP粒径10～25 µm，PE21粒径小、比表面积大，且EC具有黏性使载药微粒表面吸附有PC， 0.5 h后，微粒表面吸附及靠近微粒外层的药物迅速释放，使得PE21在0.5 h后的释放较快，此后，因EC的存在出现缓释特征。

2.8 模型拟合与释药机制分析

为了进一步阐明不同药载比原花青素微粒的体外释药特性，探讨其释药机理，在上述结果的基础上，采用4种动力学模型对PC-MP、PE21的释放曲线进行拟合[11]，包括：零级动力学模型（Qt=kt）、一级动力学模型[ln（1-Qt）=-kt]、Higuchi模型（Qt=kt0.5）、Ritger-Peppas模型（Qt=ktn）。

式中：为t时刻的累积释放分数；k为释放常数；Ritger-Peppas模型中的n值表示释放机制，n≤0.45为菲克扩散（Fick diffusion），n≥0.89为骨架溶蚀，当n值介于二者之间为非菲克扩散（结合扩散与骨架溶蚀作用）[12]。根据所得方程的相关系数R2，判断释放方程拟合的最佳模型。

由表2可知，零级动力学模型拟合结果最差，表明药物与微粒释放不是恒定的即非控释；一级动力学模型拟合效果仅次于Ritger-Peppas模型，且PC-MP的R2大于PE21，原因可能是累计释放曲线PC-MP在2～12 h阶段为一级动力学释放。原花青素微粒的体外释放最佳模型为Ritger-Peppas模型，两者n值均小于0.45，因此其释放机制为菲克扩散，属于非稳态扩散。

表2 原花青素缓释微粒体外释放的拟合结果

3 讨论

据图1结果推测生产PC时可能采用了喷雾干燥工艺，因而形成了大量中空球形粒子、且在快速固化过程中发生表面塌陷，这与文献报道中喷雾干燥过程中的条件、处方组成等多种因素造成可能造成微粒表面皱褶相符合[13-14]。而本文采用涂膜粉碎法制备微粒的过程中，将PC粒子复溶、自然挥干之后再粉碎，完全改变了PC原料药的原有形貌，与文献中采用涂膜粉碎法制备微胶囊的结果相似[9]，均呈现不规则的颗粒且粒径较大。比较EC涂膜粉碎法处理前后，EC粒子的形态改变更明显，从酥松块状物转变为成片的细小均匀微粒，此结果与EC的特性一致。此法操作简单，可用于制备微米级且密度更小、力学性能更好的聚合物微粒。以上可表明不同的制备工艺对粒子形态有极大影响。

研究表明，当溶液中化合物浓度超过其无定形形式的溶解度时，就会在过饱和溶液中形成聚集体。在此浓度（通常为结晶溶解度的5～50倍）下，会超过化合物液体形式的混溶性极限，并发生液-液相分离（LLPS），从而形成初始为胶体大小的药物富集相[15]。因PC的极性比EC大，亲水性较EC好，在乙醇溶剂挥发剩余部分水时更易形成药物富集区；而EC不溶于水、极性小，在溶剂中乙醇挥发完之后产生相分离且比PC早，不易形成药物富集区；载药微粒因PC与EC发生相互作用形成分子间氢键， EC极性小于PC，且PC结构中有苯环不易变形，EC结构中无苯环易变形，在乙醇挥发之后EC不溶于剩余水分，使得EC包裹PC形成较规则且粒径较EC大的粒子，未被包裹的PC则形成药物富集区。还可能因EC具有黏性，可吸附PC形成药物富集区，在干燥过程中形成粘连结块。

本文采用涂膜粉碎法成功制备了载PC的EC缓释微粒，结果表明通过改变药载比能方便有效地调节所得载药微粒的形态，进而影响其载药和释药性能，证实涂膜粉碎用于制备载药微粒高效便捷、可控性强。本研究为涂膜粉碎工艺推广用于其他活性成分制剂开发奠定了基础，也对微粒结构和性能的调控策略进行了有益探索。