草莓脱毒苗工厂化优化生产方法

伊万伟 汤生兵

（1. 酒泉职业技术学院，甘肃 酒泉 735000；2. 酒泉龙德盛农业科技有限公司，甘肃 酒泉 735000）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）为蔷薇科草莓属多年生草本植物，适应性强，果实柔软多汁、甜酸适口、营养丰富，具有较高的经济价值。目前草莓苗主要用匍匐茎进行无性繁殖，但多年的无性繁殖会使病毒累积在草莓植株体内，导致草莓病毒病频发、品种退化严重。利用组织培养技术培育草莓脱毒苗是恢复草莓优良性状、防治草莓病毒病、提高草莓产量和品质的有效途径。

草莓脱毒苗的生产成本高，且脱毒技术复杂、脱毒周期长，给工厂化生产带来了难度。简化、优化草莓脱毒苗工厂化生产的环节，如直接采用茎尖脱毒培养［1］，同时在增殖培养和生根培养阶段降低培养基用量，可降低脱毒苗的培养成本，促进草莓脱毒苗的规模化生产。为验证用茎尖脱毒培养、增殖和生根培养方法培育草莓脱毒苗的效果，我们于2022年4月中旬开展了相关试验，现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为红颜草莓苗的匍匐茎茎尖，由酒泉龙德盛农业发展有限责任公司提供。

1.2 试验方法

试验设在酒泉职业技术学院生物工程学院组培室。

1.2.1 茎尖脱毒培养

4 月是草莓匍匐茎生长旺盛时期，选晴天上午取材。从无病健壮的草莓植株上剪取匍匐茎顶芽嫩梢3～5 cm，用自来水冲洗干净后，将匍匐茎顶芽嫩梢用70%酒精浸泡30 s，再用2%次氯酸钠溶液消毒15 min，然后用无菌水冲洗6遍，最后将匍匐茎顶芽嫩梢置于已灭菌的滤纸上，吸干表面水分。在解剖镜下用解剖针剥去嫩梢外层幼叶，用已消毒的解剖刀快速切取3 个不同长度带1～2 个叶原基生长点的茎尖，茎尖长分别为0.2～0.5 mm、0.5～0.8 mm、0.8～1.0 mm，即3 个处理。将茎尖立即接种到无菌培养基（MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L）培养，培养基中添加30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 琼脂粉，将培养基pH 值调至5.75～5.85 后分装到培养瓶中，高温高压灭菌后待用。每个处理接种10瓶，每瓶接种3个茎尖。接种后将培养瓶放入人工气候箱，在温度25 ℃、黑暗条件下培养5 d，然后在温度25 ℃、光照强度2 000 lx、光照时间10 h/d条件下培养25 d。培养期间观察草莓苗的生长情况，统计成活率和脱毒率。

脱毒率（%）=脱除病毒的叶片数/检测叶片数×100

1.2.2 增殖培养

以培养基不同用量，即MS、1/2 MS、1/3 MS［2］为3 个处理进行草莓增殖培养。在基础培养基中添加0.8 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA、30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 琼脂粉，将培养基pH 值调至5.75～5.85 后分装到培养瓶中，高温高压灭菌后待用。将培养瓶放在温度25 ℃、光照强度2 000 lx、光照时间14 h/d条件下培养。培养期间观察草莓芽的增殖情况。

1.2.3 生根培养

以培养基不同用量，即MS、1/2 MS、1/3 MS［2］为3 个处理进行草莓生根培养。在基础培养基中添加0.1 mg/L NAA、30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 琼脂粉，将培养基pH 值调至5.75～5.85 后分装到培养瓶中，高温高压灭菌后待用。培养期间观察草莓苗的生根情况。

2 结果与分析

2.1 茎尖大小对草莓苗成活率、脱毒率的影响

茎尖大小对草莓苗成活率、脱毒率的影响见表1。

表1 茎尖大小对草莓苗成活率、脱毒率的影响

接种不同长度的草莓茎尖均可诱导出苗，但茎尖长度对草莓苗的成活率和脱毒率影响较大，茎尖脱毒培养一般要求茎尖长度小于1.0 mm。由表1 可知，茎尖长度0.8～1.0 mm 处理草莓苗的成活率较高（86.7%）、脱毒率为0，茎尖长度0.5～0.8 mm 处理草莓苗的成活率为66.7%、脱毒率为10.2%，茎尖长度0.2～0.5 mm 处理草莓苗的成活率最低（40.0%）、脱毒率为62.0%。虽然茎尖越短，成活率越低，相对培养脱毒苗较难，但越靠近茎顶端区域，植物病毒的浓度越小，脱毒率则越高。可见，培育草莓脱毒苗应选用长度为0.2～0.5 mm 的茎尖较合适。

2.2 培养基不同用量对草莓增殖培养的影响

培养基不同用量对草莓增殖培养的影响见表2。

由表2 可知，在草莓增殖培养过程中，MS 培养基处理芽苗的增殖倍数为4.0、芽苗长势良好，1/2MS 培养基处理芽苗的增殖倍数为3.8、芽苗长势良好，1/3MS 培养基处理芽苗的增殖倍数为2.1；MS 培养基处理和1/2MS 培养基处理芽苗的增殖倍数、芽苗长势差异不大，1/3MS 培养基处理芽苗的增殖倍数和生长情况显著降低。可见，使用1/2MS培养基进行草莓增殖培养，既可保证芽苗多增殖，又可降低生产成本。

2.3 培养基不同用量对草莓生根培养的影响

培养基不同用量对草莓生根培养的影响见表3。

表3 培养基不同用量对草莓生根培养的影响

把增殖培养的丛生芽切成单株接种到生根培养基上进行培养，20 d后部分小苗基部开始膨大，逐渐出现不定根。由表3 可知，在草莓生根培养过程中，MS 培养基处理芽苗的生根率最高（92.5%）、根系长势良好，1/2MS 培养基处理芽苗的生根率为90.6%、根系长势良好，1/3MS 培养基处理芽苗的生根率最低（73.5%）；1/2MS培养基处理芽苗的生根效果与MS培养基处理差异不大，1/3MS培养基处理芽苗的生根率、根系长势显著降低。可见，用1/2MS培养基进行草莓生根培养较合适。

3 小结与讨论

活跃生长的茎尖分生组织的代谢水平高能抑制病毒的繁殖，采用茎尖脱毒培养可获得大量优质的脱毒苗。茎尖培养是培育草莓脱毒苗的常见方法，其脱毒效率高、速度快，能在较短的时间内得到原种繁殖材料，但草莓苗成活率不高。可采用茎尖脱毒培养和热处理等多种脱毒方法相结合的方式进行草莓脱毒苗生产。如高遐虹等［3］采用二次茎尖培养的方法培育草莓脱毒苗，赵海红［4］采用热处理和二次茎尖培养相结合的方法培育草莓脱毒苗。多种脱毒方法相结合的方式虽然提高了脱毒率，但规模化生产效率并未得到显著提高，可能是脱毒流程多、操作步骤繁琐、时间长和操作失误等原因所致。

在茎尖脱毒培养中，要求茎尖长度小于1.0 mm，靠近顶端的茎尖脱毒率较高，但在实际操作过程中，小的茎尖于接种培养2 周内易变为褐色而枯死，成活率较低。因此茎尖的取材和消毒非常重要。一般选晴天上午取材，利于茎尖的剥离和培养；由于外植体来自于田间，附有大量细菌，需严选消毒剂种类和浓度、消毒时间，如外植体需用70%酒精液浸泡30 s，再用2%次氯酸钠溶液消毒15 min，然后用无菌水冲洗6遍。此消毒方法对外植体的消毒效果较好，对茎尖的损伤也较小。

草莓脱毒苗工厂化生产应综合考虑生产效率、脱毒效率和生产成本，以获得较高的经济效益。试验结果表明，采用长度为0.2～0.5 mm 的茎尖、1/2 MS 培养基培育草莓脱毒苗，虽然成活率较低，但脱毒率较高，既可简化脱毒环节、保证芽苗的增殖倍数、提高生根效果，又可降低生产成本，在保证一定的脱毒率和成活率的同时提高生产效率。