胆固醇酯对非酒精性脂肪肝药物治疗的影响

朱豆豆， 朱升龙， 崔思远， 陆旭阳， 陈永泉*

（1 .江南大学 无锡医学院，江苏 无锡 214122；2. 无锡市第二人民医院，江苏 无锡 214122）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是最常见的肝病之一[1]。 研究表明饮食结构与NAFLD 的发生与发展以及后期的治疗效果紧密相关[2-4]，其中膳食补充胆固醇对肝脏代谢稳态具有至关重要的影响[5]，相关流行病学研究表明， 膳食摄入胆固醇是导致NAFLD恶化的独立危险因素之一[6-7]。

胆固醇（total cholesterol，TC）可分为游离态胆固醇（free cholesterol，FC）和胆固醇酯（CE），两种形式的胆固醇在机体代谢中保持动态平衡[8]。 关于食物中CE 的报道多集中在禽蛋、蟹黄[9]以及猪油[10]中，其中每100 g 鸡蛋蛋黄中胆固醇酯质量为117~140 mg，且油酸胆固醇酯最多[11]。摄入两种不同形式的胆固醇对NAFLD 发展以及肝脏内脂质代谢稳态的影响可能存在质的不同，这可能是由于两者结构[12-13]以及合成吸收的途径不同所导致。 在细胞内，CE 由胆固醇酰基转移酶（SOAT）酯化而成，而FC则主要由乙酰辅酶A 在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶 （HMGCR） 和角鲨烯单加氧酶的作用下于内质网膜中合成[8]。 FC 可由尼曼-匹克C1 型类似蛋白1（NPC1L1）直接介导吸收[14]，而CE 在吸收前需要被胰胆固醇酯酶水解[15]。目前关于NAFLD 的研究多侧重于FC[16]，关于CE 的研究相对较少。近年来多项研究表明CE 可影响多种疾病的诊疗， 例如阿尔茨海默病和前列腺癌等[17-19]，然而CE 是否影响NAFLD 的治疗，目前尚不清晰。

非诺贝特（fenofibrate，Feno）是临床上广泛用于治疗NAFLD 的药物，在一项包括16 例经活检证实为NAFLD 患者的研究中，使用非诺贝特（200 mg/d）48 周可显著改善患者的胰岛素敏感性和血脂水平[20]。因此，作者采用非诺贝特治疗的NAFLD 小鼠模型，探究膳食补充CE 对NAFLD 药物治疗的影响及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 苏木精-伊红染液试剂盒、油红染色液：南通雨露生物公司产品；胰岛素：通化东宝药业股份有限公司产品；小鼠谷丙转氨酶与甘油三酯测试试剂盒： 南京建成生物公司产品；RNA 提取试剂盒、SYBR 混合物、HiFi PCR 混合物： 北京康为世纪生物科技有限公司产品； 反转录试剂盒：Takara 公司产品；第二链cDNA 合成试剂盒：碧云天生物公司产品；凝胶回收试剂盒：南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。

非诺贝特（使用生理盐水配制，振荡器充分涡旋混匀）： 美国雅培制药有限公司产品；CE：TCI 公司产品；高脂饲料（脂肪质量分数60%，美国营养学会AIN-93 标准）：南通特洛菲饲料科技有限公司产品。60%高脂饲料+1%CE 饲料（均为质量分数）由南通特洛菲饲料科技有限公司制备， 并经60Co 辐照灭菌，所有饲料储存于4 ℃，使用前取出恢复至室温。

1.1.2 主要仪器设备 石蜡包埋机、全自动轮转式切片机、冰冻切片机：德国Leica 公司产品；QP2010 Ultra 型气相色谱质谱联用仪： 日本岛津公司产品；Vanquish Q Exactive Plus 型超高效液相色谱、 酶标仪：美国Thermo 公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物模型建立 动物实验方案及所有程序经江南大学动物伦理委员会批准 （批准协议号：JN.No20190330c0700710[36]）。 从SPF（北京）生物技术有限公司（中国）购买6 周龄的雄性C57BL/6J小鼠，适应实验室条件1 周。 1）高脂或正常饲料喂养小鼠13 周以建立NAFLD 小鼠模型。 将19 只小鼠分为正常饮食组（normal diet，ND，n=5）、高脂饮食组 （high fat diet，HFD，n=7） 以及非诺贝特治疗组（HFD-Feno，100 mg/kg，n=7），药物治疗组小鼠隔天经灌胃给药，HFD 组小鼠给予生理盐水作为对照，持续10 周。 2）使用6 周龄的雄性C57BL/6J 小鼠，高脂饲料喂养13 周以建立NAFLD 小鼠模型。将21只小鼠分为高脂饮食组（HFD，n=7）、非诺贝特治疗组（HFD-Feno，100 mg/kg，n=7）以及补充质量分数1%CE 的非诺贝特治疗组（HFD-CE-Feno，n=7）。 药物治疗组小鼠隔天经灌胃给药，HFD 组小鼠给予生理盐水作为对照，持续10 周。

1.2.2 组织病理学检查 苏木精-伊红染色参照之前方法[21]。 对于油红染色，将储存在-80 ℃冰箱的组织切成8 μm 厚的切片，并用质量分数4%甲醛固定30 min。然后使用油红染色试剂盒对切片进行染色。

1.2.3 总胆固醇酯与胆固醇酯种类的测定 气相色谱-质谱法（GC-MS）用于检测TC、FC 以及CE 质量分数。样品制备步骤如下：20 mg 肝脏组织于500 μL 纯水中匀浆，取100 μL 匀浆液或25 μL 血清置于10 mL 塑料离心管。 同一样品做6 个平行样，分为两组（TC 组标记为A1、A2、A3；FC 组标记为B1、B2、B3）。 A 组样品加入1 mL 1 mol/L 氢氧化钾-乙醇溶液检测TC，涡旋15 s，70 ℃金属浴1 h。 B 组加入1 mL 乙醇测定FC，充分涡旋。

两组后续处理如下：分别向上述混合液中添加1 mL 超纯水、3 mL 正己烷，充分涡旋15 s，2 000 r/min离心10 min，分层。 转移上清液到新的塑料离心管中，向原管剩余液体中加入3 mL 正己烷，重复提取一次，混匀。吸取1 mL 上清液转移至1.5 mL EP 管，用氮气吹干。 向干燥的EP 管中添加50 μL BSTFA混匀并在75 ℃金属浴1 h， 进行衍生化。 离心，取40 μL 混合液体至棕色气相瓶，上机或储存在-80 ℃冰箱。

1.2.4 转录组学分析 对于文库的制备， 使用Ultrapure RNA 试剂盒提取总RNA。此外使用RT 试剂盒合成具有1 μg 总RNA 的cDNA。 使用第二链cDNA 合成试剂盒合成第二链cDNA。使用凝胶回收试剂盒纯化文库片段。 使用HiFi PCR 混合物扩增混合物，回收目标产物并进行PCR。

使用Qubit®3.0 中的Qubit®RNA 分析试剂盒测量文库中的RNA 浓度以进行初步定量， 然后将其稀释至1 ng/μL。使用Agilent Bioanalyzer 2100 系统评估插入物的大小， 并使用StepOnePlusTM实时PCR 系统（库中有效浓度>10 nmol/L），将合格的插入物进行准确定量。 使用HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS（Illumina）在cBot 群集生成系统上对索引编码的样本进行群集。产生簇后，在Illumina 平台上对文库进行测序，并产生150 bp 的配对末端读段。

1.2.5 实时荧光定量PCR 使用反转录试剂盒从1 μg 总RNA 中合成cDNA， 使用Ultra SYBR 混合物进行实时荧光定量PCR（RT-QPCR）。根据3 个独立实验样品的阈值循环值分析数据。 引物见表1。

表1 qPCR 引物序列Table 1 qPCR primer sequence

1.3 统计分析

使用SPSS 25.0 版进行数据的正态性和方差齐性分析。 所有数据均使用GraphPad Prism 7 进行分析，数据表示为平均值±标准差。 两组间比较时，如果数据满足正态性、独立性且方差齐性，则统计检验方法选用独立样本t 检验； 两组以上数据比较采用单因素方差分析，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 非诺贝特治疗NAFLD 的效果分析

高脂饮食饲喂13 周以建立NAFLD 小鼠模型，连续10 周隔天灌胃给药后，观测药物疗效。

与HFD 组相比，非诺贝特在不影响小鼠肝脏质量和白色脂肪质量的同时显著降低体质量。 此外，治疗期间的小鼠进食量无显著差异（见图1）。

图1 非诺贝特对小鼠体质量以及组织质量的影响Fig. 1 Effect of fenofibrate on the body weight and tissue weight of mice

从图2（a）、2（b）可知，同HFD 组小鼠相比，非诺贝特可以显著降低小鼠肝脏内甘油三酯（triglycerides，TG） 和谷丙转氨酶 （alanine aminotransferase，ALT）水平。图2（c）是染色后的肝脏石蜡切片与冰冻切片， 与ND 组相比，HFD 组小鼠肝脏存在明显的脂质堆积。 同HFD 组小鼠相比，HFDFeno 组小鼠肝脏的脂质堆积情况得到显著改善。

图2 非诺贝特对小鼠肝脏的影响Fig. 2 Effect of fenofibrate on the liver of mice

2.2 膳食补充CE 对小鼠肝脏中CE 的影响

非诺贝特能够有效缓解NAFLD 的症状， 在膳食补充CE 后， 药物治疗组小鼠肝脏内的胆固醇质量分数发生明显改变。如图3 所示，相较于HFD 组，非诺贝特显著降低了小鼠肝脏中的CE 水平， 但膳食添加CE 抵消了非诺贝特对NAFLD 小鼠肝脏中CE 的调控作用。 其中，胆固醇油酸酯是小鼠肝脏中CE 增加的主要形式。

图3 膳食补充CE 对小鼠肝脏胆固醇酯水平的影响Fig. 3 Effects of dietary CE on hepatic cholesterol levels of mice

2.3 膳食补充CE 对非诺贝特药效的影响

如图4 所示，非诺贝特治疗10 周后，与HFDFeno 组相比，膳食补充CE 在不影响体质量与白色脂肪质量的同时可增加小鼠肝脏质量。 但与HFDFeno 组小鼠相比，HFD-CE-Feno 组小鼠的血糖水平没有显著改变。

图4 膳食补充CE 对小鼠组织质量及血糖水平的影响Fig. 4 Effects of dietary CE on tissue weight and blood glucose level of mice

从图5（a）可知，HFD-CE-Feno 组小鼠肝脏中TG 水平并未显著增加，但具有升高的趋势。 小鼠肝脏的石蜡切片与冰冻切片染色结果也一致表明，膳食补充CE 可削弱非诺贝特对NAFLD 小鼠的治疗效果（见图5（b））。

图5 膳食补充CE 对非诺贝特治疗小鼠肝脏的影响Fig. 5 Effect of dietary CE on the liver of mice treated with fenofibrate

2.4 补充CE 对非诺贝特治疗的NAFLD 小鼠肝脏脂质相关基因转录组水平的影响

如图6（a）所示，非诺贝特调控基因中倍数改变前20 的基因聚类显示，在补充CE 后，非诺贝特调控的基因呈现相反的变化。 从图6（b）可知，非诺贝特上调的151 个基因中， 有78 个基因在膳食补充CE 后下调；而在非诺贝特下调的167 个基因中，有75 个发生上调。

图6 膳食补充CE 对脂质相关基因表达的影响Fig. 6 Effect of dietary CE on lipid-related gene expression

为进一步探究这些差异基因所参与的代谢途径，分别对两组差异基因进行GO 富集分析。 如图7（a）所示，非诺贝特主要影响甘油三酯代谢、脂肪酸的β 氧化以及PPAR 信号通路，尤其是胆固醇酯化途径。 而在HFD-CE-Feno 组，补充CE 主要影响甘油三酯代谢以及蛋白质入核（见图7（b））。

图7 膳食补充CE 对脂质相关通路的影响Fig. 7 Effect of dietary CE on lipid-related pathways

从图8 可知，在高脂饮食情况下，非诺贝特显著升高氧化磷酸化相关基因Atp5b 以及Cycs 在肝脏中的mRNA 水平，而在HFD-CE-Feno 组，两者均显著降低。 同HFD 组相比， 非诺贝特显著升高Pparα 以及Cpt1a 的mRNA 水平，而CE 则逆转了非诺贝特对该基因的调控作用。 尽管CE 并未影响Fasn 以及Acc1 的 表 达， 但 补 充CE 后，Dgat2 的mRNA 水平呈倍数增加，具有明显上升趋势。 此外，非诺贝特显著降低胆固醇酯化基因Soat1 与Soat2的表达，膳食补充CE 抵消了非诺贝特的影响。由此可以推测， 补充CE 改变了非诺贝特对脂肪酸代谢以及胆固醇酯化的调控作用。

图8 脂质相关通路基因的表达变化Fig. 8 Changes in the expression of lipid-related pathway genes

先前研究表明， 肥胖与血液中CE 水平显著相关， 肥胖受试者肝脏中CE 的水平相比于对照组增加了3 倍[22]。 成像数据显示在重症前列腺癌和转移的脂滴中存在酯化胆固醇的积累[18]。 此外，CE 影响动脉粥样硬化[23-24]、乳腺癌[25]、白血病[26]和神经胶质瘤[27]等多种疾病，这表明CE 也可能在疾病发展中起关键作用。

NAFLD 的发生通常与肝脏中甘油三酯的升高有关[28]，然而，最近的研究表明胆固醇稳态在NAFLD中起着核心作用[29]。作为临床常用于治疗NAFLD 的药物， 非诺贝特与TG 和高密度脂蛋白胆固醇水平的改善紧密相关[30-31]。 然而，就非诺贝特对胰岛素敏感性和葡萄糖代谢的影响而言，结果喜忧参半[32-33]。在该研究中， 膳食补充CE 在增加小鼠肝脏中CE的同时削弱了非诺贝特对NAFLD 小鼠的治疗效果。 因此猜测非诺贝特临床治疗效果差异显著的一个潜在原因可能是患者肝脏中CE 的水平不同，这可能是饮食中过量摄入CE 导致的。此外，干预生活方式仍是目前治疗NAFLD 的重要手段， 通过控制饮食减轻体质量可显著减少肝脂肪变性和炎症[34]。因此合理适量的调整饮食，即减少非诺贝特治疗的NAFLD 患者饮食中CE 的摄入或可进一步改善药物的治疗效果。 然而，CE 如何介入非诺贝特治疗NAFLD 的具体机制仍需进一步研究。

3 结 语

膳食补充CE 会增加小鼠肝脏中CE 水平，在不影响体质量的同时抵消非诺贝特治疗小鼠NAFLD 的效果。 此外CE 影响了甘油三酯代谢以及蛋白质入核过程，同时逆转了非诺贝特对氧化磷酸化、脂肪酸氧化以及脂质生成相关基因表达的调节作用。 尽管NAFLD 对人体健康造成很大影响，但治疗疾病可选择的方案仍然有限。因此，开发与CE 相关的治疗NAFLD 的手段以及探究如何通过膳食指导提高药物疗效应引起关注。