PPARα调控SOD2表达的机制研究

杨锡彤，秦 燕，杜小珊，徐弘扬，王光明*

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.大理大学第一附属医院，云南大理 671000）

PPAR（过氧化物酶体增殖物激活受体）是一类由配体激活的核转录因子，属于核激素受体超家族成员之一，包括α，β，γ 3种亚型，均具有调节靶基因表达的功能〔1〕。非诺贝特是PPARα的配体，因能降低甘油三脂和胆固醇而在临床上作为降脂药物广泛使用〔2〕。而近年研究表明，贝特类药物除降脂作用外，还是PPARα的激动剂〔3〕。PPARα的配体包括Clofibrate、Gemfibrozil、Wy14634和非诺贝特等，除了降脂作用外还有抗炎和抗氧化作用等〔4〕。SODs是ROS（活性氧）防御系统中最原始也是最重要的抗氧化酶〔5〕。SODs 包括SOD1（Cu∕Zn-SOD）、SOD2（Mn-SOD）、SOD3（ecSOD）3种亚型，其中SOD2作为辅因子存在于需氧细胞的线粒体内，其物理结构由5个外显子和4个内含子构成。SOD2以同源四聚体存在，在促进细胞分化和肿瘤发生过程中起重要的作用，并能防止氧过多而引起的肺毒性作用〔6〕。

前期研究表明，小鼠在脑缺血状态下，SODs的表达下降，但经过PPARα的激动剂非诺贝特或Wy14643处理后，SODs表达明显升高〔7-8〕，从而非诺贝特和Wy14643能起到保护神经的作用，但是目前非诺贝特或Wy14643如何影响SODs的表达其机制尚不清楚。因此在2013年3月至2016年5月本研究通过在细胞水平，利用培养的BMEC经非诺贝特处理后，用实时荧光定量PCR的方法检测非诺贝特是否影响PPARα和SOD2的表达；利用C57BL∕6小鼠经非诺贝特处理，分离脑微血管，用实时荧光定量PCR的方法检测非诺贝特是否在动物水平影响PPARα和SOD2的表达；用pGL4 mSOD2（含SOD2基因启动子序列）或pGL4 mu mSOD2（含SOD2基因启动子中PPRE结合区域突变）荧光素酶报告质粒，BMEC经过转染后用非诺贝特处理，检测BMEC中的荧光素酶活性，以研究非诺贝特如何调节SOD2的表达。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂15只6～8周龄的雄性C57BL∕6小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SCXK2016（湘）0002）；CMC（羧甲基纤维素，Sigma公司）；DMSO（二甲基亚砜，Sigma公司）；非诺贝特（Sigma公司）；lipofectamine2000引物合成，总RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒和定点突变试剂盒均由Invitrogen公司（Carlsbad，CA）提供，实时荧光定量PCR试剂盒购自Bio-Rad公司（Richmond，CA），荧光素酶报告系统购自Promega公司（Madison，WI），BMEC细胞购自北京钧尧伟业生物科技有限公司（CRL-3245），其余试剂未作特殊说明均来自Sigma公司。

1.2 细胞培养及非诺贝特处理BMEC生长在含10%的胎牛血清、100 IU∕mL青霉素和链霉素的F12培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，每3～4天传代1次，5～6代用于实验。细胞传代后，当细胞生长到培养皿底部的70%～80%，换不含血清和双抗的F12培养基过夜处理，第2天加入终浓度为10 μg∕mL的非诺贝特（溶解于DMSO中）处理12 h（实验组），对照组用同等体积的DMSO处理。收获细胞，提取总RNA。

1.3 C57BL∕6小鼠的处理雄性C57BL∕6小鼠购买回来后，随机分为2组，实验组7只，在试验中给予Feno干预；对照组（8只）用制作非诺贝特混悬液的试剂CMC处理。为适应环境，在大理大学动物中心饲养1周，然后灌胃给药，分别给予30 mg∕kg Feno、10 mL∕kg 5%CMC混悬液处理，连续给药7 d，每次给药时间均控制在上午8：00—8：30间。在第7天给药30 min内处死小鼠，取脑组织置于4℃的PBS（pH 7.4）中分离脑微血管用于后续实验。

1.4 脑微血管的分离按照参照文献〔7〕介绍的方法分离小鼠脑微血管，上述脑组织去除脑膜后在3 mL的0.1 mol∕L PBS中匀浆，4 ℃、2 000 g离心5 min，沉淀物用3 mL 0.1 mol∕L PBS混悬后在混悬液的上方加入5 mL的15%右旋糖苷溶液（0.1 mol∕L PBS配制）中，4℃、3 500 g离心35 min后，沉淀物用冷的0.1 mol∕L PBS混悬，过孔径为40 μm的尼龙膜，收获尼龙膜上方的部分即为脑微血管，提取总RNA。

1.5 实时荧光定量PCR检测PPARα和SOD2的表达为了在细胞水平和动物水平阐明非诺贝特对SOD2表达的影响及是否激活PPARα，从非诺贝特处理的BMEC和非诺贝特处理的小鼠脑微血管提取总RNA，并反转录为cDNA。总RNA的提取和反转录总RNA为cDNA均依照Invitrogen公司的RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒说明书进行，然后用Bio-Rad公司的iQ SYBR Green试剂盒进行检测，反应体系为50 μL，其中cDNA 2 μL，SYBR Green混合物25 μL，引物各0.5 μL，其余用DEPC处理的水补齐50 μL。反应条件为95℃预变性10 min，然后95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，35个循环。PPARα、SOD2和内参18 s的引物序列见表1。

表1 PCR扩增及克隆用引物

1.6 含SOD2启动子的荧光素酶报告质粒的构建通过网上数据库：http：∕∕genome.ucsc.edu∕index.html，调取小鼠SOD2基因的启动子序列，设计引物，用小鼠的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物插入pGL4.10 Luciferase Reporter Vectors中，得到含SOD2启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL4mSOD2。

1.7 含SOD2启动子的荧光素酶报告质粒的定点突变在1 633至1 660碱基序列中，有PPAR的结合位点；序列为cgttggGGTCagagtccccgttgtttct，根据该序列及突变试剂盒的说明书，设计用于突变的引物，然后利用点突变试剂盒，把GGTC突变为CCAG，插入pGL4 Luciferase Reporter Vectors中，可得到含突变的SOD2启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL4 mu mSOD2。

1.8 荧光素酶活性检测为了阐明PPARα对SOD2表达的调节作用，以pGL4.74所携带的荧光素酶信号为内参，pGL4 mSOD2携带的信号为目的信号。为了排除细胞数量的差异，用内参信号对目的信号进行同一化处理。本研究用含SOD2启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL4 mSOD2与pGL4.74用lipofectamine2000共转染BMEC，转染24 h后用最终浓度为10 μg∕mL的非诺贝特处理12 h，收获细胞后按照试剂盒说明检测细胞中的荧光素酶活性；为了进一步研究PPARα通过与SOD2基因启动子上的PPRE结合以调节SOD2的表达，本研究用pGL4 mu mSOD2与pGL4.74共转染BMEC，24 h后经10 μg∕mL的非诺贝特处理12 h，收获细胞检测细胞中的荧光素酶活性。

1.9 统计学分析PPARα和SOD2 mRNA表达数据进行t检验，荧光素酶活性用SPSS 10.0统计软件进行one-way ANOVA分析，并进行Scheffe post hoc统计学分析。

2 结果

2.1 BMEC中PPARα和SOD2的表达BMEC给予10 μg∕mL的非诺贝特刺激12 h后，提取总RNA，逆转录总RNA为cDNA，荧光定量PCR检测结果表明PPARα和SOD2的表达明显升高（P＜0.01）。见图1～2。

BMEC给予非诺贝特处理12 h后，PPARα的表达升高；C57BL∕6经连续灌胃给非诺贝特7 d后，分离脑组织中的微血管成分，实时荧光定量PCR检测PPARα的表达升高。

图1 PPARα的表达图

2.2 C57BL∕6小鼠脑微血管中PPARα和SOD2的表达C57BL∕6小鼠灌胃给予30 mg∕kg体重的非诺贝特处理7 d后，其脑微血管中PPARα和SOD2的表达明显升高（P＜0.01）。见图1～2。BMEC给予非诺贝特处理12 h后，SOD2的表达升高；C57BL∕6经连续灌胃给非诺贝特7 d后，分离脑组织中的微血管成分，实时荧光定量PCR检测SOD2的表达升高。

图2 SOD2的表达图

2.3 荧光素酶活性变化BMEC转染pGL4.74和pGL4 mSOD2或pGL4 mu mSOD2 24 h后，BMEC给予10 μg∕mL的非诺贝特处理12 h，测定荧光素酶的活性，结果发现非诺贝特能够增强pGL4 mSOD2的活性（P＜0.01），但是把SOD2基因启动子中PPRE结合序列的关键碱基突变后，即使给予非诺贝特刺激，pGL4 mu mSOD2的活性没有明显的改变。

BMEC共转染pGL4.74和pGL4 mSOD2后，给予非诺贝特刺激，荧光素酶活性增强；当SOD2启动子区与PPRE结合的关键碱基突变后，即使给予非诺贝特刺激，荧光素酶活性也并未改变。见图3。

图3 荧光素酶活性检测图

3 讨论

PPARα主要分布在代谢活跃的组织中，例如肝脏、肾脏和心脏，其作用主要是调节脂肪酸的代谢〔9-10〕。另外，PPARα在脑组织中也广泛表达，在小鼠I∕R（缺血∕再灌注）损伤中可以抑制NOX的表达和减少氧自由基ROS的含量〔11〕以保护由于I∕R引起的损伤。非诺贝特和Wy-14643，都作为PPARα的配体，能导致过氧化物酶体的增殖和肝脏肿大。近年来的研究表明PPARα可作为部分抗氧化酶的一种表达促进剂，例如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶（SODs）和抗炎介质〔12〕。

体内的ROS主要来源于还原型辅酶Ⅱ（NADPH oxidase）等的作用，而ROS的清除主要依赖于SODs〔13〕。有研究表明，在心脏、胃、小肠、脑、视网膜等组织缺血过程中，ROS的含量升高〔14-16〕。Boshra等〔17〕在研究肝脏缺血-再灌注损伤时发现非诺贝特可以促进SODs的表达以降低ROS含量而对肝脏缺血∕再灌注损伤进行保护；Ibarra-Lara等〔18〕在心肌缺血损伤时也发现非诺贝特的类似物Clofibrate也具有相似的功能；同样的保护机制在其他脏器的缺血∕再灌注损伤的研究中得到进一步证实〔19-20〕，说明非诺贝特可能具有调节SODs表达的功能。而我们前期研究发现给予非诺贝特处理后，缺血小鼠脑组织中的ROS含量降低，进一步研究发现PPARα的表达、SOD2含量及SODs活性升高，结合PPARα作为核转录因子的功能，进一步说明非诺贝特可能是通过促进PPARα的表达以影响SOD2在体内的含量及其活性，以维持ROS在体内含量的相对稳定，从而在缺血∕再灌注损伤起保护作用。

为了进一步阐明非诺贝特调节SOD2的机制，本研究用体外实验BMEC经非诺贝特处理和体内实验C57BL∕6小鼠给予非诺贝特处理后分离脑组织中的微血管，其PPARα和SOD2的表达均升高，说明非诺贝特可以促进PPARα和SOD2的表达；进一步用SOD2基因启动子序列构建的荧光素酶报告质粒转染细胞后，经非诺贝特刺激，可以导致荧光素酶活性升高，说明非诺贝特调控SOD2的表达依赖于非诺贝特与SOD2基因间可能存在某种联系；而当SOD2基因启动子上PPRE结合序列的关键碱基发生突变后，即使给予非诺贝特刺激，pGL4 mu mSOD2的活性几乎没有改变，即由于SOD2基因启动子上的PPRE与PPARα结合的碱基发生突变，导致PPARα无法与SOD2基因启动子上的PPRE结合，从而非诺贝特激活SOD2基因启动子活性的作用消失，说明非诺贝特调节SOD2的表达依赖于PPARα与SOD2基因启动子区域上的PPRE结合，结合体内和体外实验研究得到非诺贝特具有促进PPARα和SOD2的表达功能，说明非诺贝特对SOD2表达的调控作用依赖于激活的PPARα结合到SOD2基因启动子的PPRE区域以促进SOD2基因启动子的活性，从而促进SOD2的表达。

［参考文献］

〔1〕江珊，李萍，李彦.过氧化物酶体增殖物激活受体的心血管保护作用〔J〕.中国现代医学杂志，2012，22（16）：58-62.

〔2〕BALFOUR J A，MCTAVISH D，HEEL R C.Fenofibrate：A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic prop⁃erties and therapeutic use in dyslipidaemia〔J〕.Drugs，1990，40（2）：260-290.

〔3〕赵晓燕，苏金林，温旭凯，等.非诺贝特对慢性心力衰竭患者心肌纤维化和心功能的影响〔J〕.中国现代医学杂志，2013，23（29）：46-50.

〔4〕张元元，李正金，赵立仙，等.Fenofibrate与Apocinin在脑缺血中神经保护作用的机制〔J〕.广东医学，2015，36（16）：2491-2494.

〔5〕LIOU W，CHANG L Y，GEUZE H J，et al.Distribution of CuZn superoxide dismutase in rat liver〔J〕.Free Radic Biol Med，1993，14（2）：201-207.

〔6〕ST CLAIR D K，OBERLEY T D，MUSE K E，et al.Expres⁃sion of manganese superoxide dismutase promotes cellular differentiation〔J〕.Free Radic Biol Med，1994，16（2）：275-282.

〔7〕WANG G，LIU X，GUO Q，et al.Chronic treatment with fi⁃brates elevates superoxide dismutase in adult mouse brain microvessels〔J〕.Brain Res，2010，1359：247-255.

〔8〕WANG G，NAMURA S.Effects of chronic systemic treat⁃ment with peroxisome proliferator-activated receptor α acti⁃vators on neuroinflammation induced by intracerebral injec⁃tion of lipopolysaccharide in adult mice〔J〕.Neurosci Res，2011，70（2）：230-237.

〔9〕SCHOONJANS K，WATANABE M，SUZUKI H，et al.In⁃duction of the acyl-coenzyme A synthetase gene by fibrates and fatty acids is mediated by a peroxisome proliferator re⁃sponse element in the C promoter〔J〕.J Biol Chem，1995，270（33）：19269-19276.

〔10〕BRAISSANT O，FOUFELLE F，SCOTTO C，et al.Differ⁃ential expression of peroxisome proliferator-activated re⁃ceptors（PPARs）：tissue distribution of PPAR-α，-beta，and-gamma in the adult rat〔J〕.Endocrinology，1996，137（1）：354-366.

〔11〕GUO Q，WANG G，NAMURA S.Fenofibrate improves ce⁃rebral blood flow after middle cerebral artery occlusion in mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30（1）：70-78.

〔12〕RAMANAN S，KOOSHKI M，ZHAO W，et al.PPARα li⁃gands inhibit radiation-induced microglial inflammatory responses by negatively regulating NF-kappaB and AP-1 pathways〔J〕.Free Radic Biol Med，2008，45（12）：1695-1704.

〔13〕TANG X N，CAIRNS B，KIM J Y，et al.NADPH oxidase in stroke and cerebrovascular disease〔J〕.Neurol Res，2012，34（4）：338-345.

〔14〕SONG J W，KIM H J，LEE H，et al.Protective Effect of Peroxisome Proliferator-Activated Receptorα Activation against Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury Is Related to Upregulation of Uncoupling Protein-3〔J〕.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2016，2016：3539649.

〔15〕MORAN E，DING L，WANG Z，et al.Protective and anti⁃oxidant effects of PPARα in the ischemic retina〔J〕.In⁃vest Ophthalmol Vis Sci，2014，55（7）：4568-4576.

〔16〕DI PAOLA R，IMPELLIZZERI D，TORRE A，et al.Ef⁃fects of palmitoylethanolamide on intestinal injury and in⁃flammation caused by ischemia-reperfusion in mice〔J〕.J Leukoc Biol，2012，91（6）：911-920.

〔17〕BOSHRA V，MOUSTAFA A M.Effect of preischemic treatment with fenofibrate，a peroxisome proliferator-acti⁃vated receptor-α ligand，on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.J Mol Histol，2011，42（2）：113-122.

〔18〕IBARRA-LARA L，HONG E，SORIA-CASTRO E，et al.Clofibrate PPARα activation reduces oxidative stress and improves ultrastructure and ventricular hemodynamics in no-flow myocardial ischemia〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2012，60（4）：323-334.

〔19〕XUAN A G，CHEN Y，LONG D H，et al.PPARα Agonist Fenofibrate Ameliorates Learning and Memory Deficits in Rats Following Global Cerebral Ischemia〔J〕.Mol Neuro⁃biol，2015，52（1）：601-609.

〔20〕SUR A，KESARAJU S，PRENTICE H，et al.Pharmacolog⁃ical protection of retinal pigmented epithelial cells by su⁃lindac involves PPAR-α〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（47）：16754-16759.