非诺贝特对人BMEC与小鼠脑微血管组织SOD3表达的影响及机制

杜小珊，杨锡彤，徐弘扬，程建杰，王光明

(大理大学第一附属医院，云南大理671000)

非诺贝特对人BMEC与小鼠脑微血管组织SOD3表达的影响及机制

杜小珊，杨锡彤，徐弘扬，程建杰，王光明

(大理大学第一附属医院，云南大理671000)

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α亚型(PPARα)激动剂非诺贝特对人脑微血管内皮细胞(BMEC)与小鼠脑微血管组织细胞外铜/锌超氧化物歧化酶(SOD3)表达的调节作用及其机制。方法 将培养好的BMEC随机分为两部分，分别加入终浓度为10 μg/mL非诺贝特、同等体积的DMSO处理12 h；将15只小鼠随机分为两部分，分别给予30 mg/kg非诺贝特、10%的羧甲基纤维素混悬液10 mL/kg连续灌胃7 d，处死小鼠取脑组织，提取脑微血管；用RT-PCR技术检测BMEC与脑微血管组织内过氧化物酶体增殖物激活受体α亚型(PPARα)、SOD3的mRNA表达。构建含SOD3启动子荧光素酶报告质粒pGL4 mSOD3，用突变试剂盒定点获得过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)序列突变的荧光素酶报告质粒pGL4 mu mSOD3，将pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3转染BMEC 24 h，取部分细胞用终浓度10 μg/mL的非诺贝特处理12 h，检测细胞荧光素酶活性。结果 经非诺贝特处理后，BMEC及小鼠脑微血管组织中PPARα、SOD3 mRNA表达均升高(P均<0.05)。转染pGL4 mSOD3 24 h，经非诺贝特处理后BMEC内pGL4 mSOD3的荧光素酶活性增强(P<0.05)；转染pGL4 mu mSOD3 24 h，经非诺贝特处理的BMEC荧光素酶活性变化不明显(P>0.05)。结论 非诺贝特通过激活PPARα从而调节人BMEC与脑微血管组织中SOD3的表达。

非诺贝特；细胞外铜/锌超氧化物歧化酶；脑微血管；脑微血管内皮细胞

超氧化物歧化酶(SOD)在机体中能消除新陈代谢过程中产生的有害物质，其有三种亚型：胞质内的SOD1、线粒体内SOD2及细胞外铜/锌超氧化物歧化酶(SOD3)[1]。SOD的耗竭或内源性抗氧化系统的破坏是缺氧导致组织损伤的机制[2，3]。缺血会导致脑组织中SOD表达下降。过氧化物酶体增殖物激活受体α亚型(PPARα)激动剂非诺贝特可诱导脑组织微血管及肾小管中SOD表达升高，从而发挥神经保护作用及肾脏保护作用[4，5]，但其具体作用机制尚不清楚。2013年2月～2016年4月，本研究在细胞水平与动物水平探讨非诺贝特对SOD3表达的影响；利用含基因SOD3启动子序列或过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)序列突变启动子构建的荧光素酶报告质粒分析非诺贝特调节SOD3表达的相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 C57BL/6小鼠15只，6～8周龄，体质量22～25 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。非诺贝特、二甲基亚砜(DMSO)、羧甲基纤维素(CMC，Sigma公司)，Lipofectamine2000、TRIzol、cDNA合成试剂盒、定点突变试剂盒(Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(Bio-Rad公司)；荧光素酶报告质粒pGL4.10、pGL4.74(Promega公司)；人脑微血管内皮细胞(BMEC)、引物(北京钧尧伟业生物科技有限公司)。

1.2 BMEC培养及处理 BMEC用含10% FBS、100 U/mL的青霉素和链霉素的F12培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养，长满培养皿底部的90%左右用0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，传5～6代用于实验，细胞传代并长满培养皿底部的70%～80%，换新鲜的F12培养基过夜，继续培养12 h。将细胞随机分为两部分，分别加入终浓度为10 μg/mL的非诺贝特、同等体积的DMSO处理12 h，收集细胞。

1.3 小鼠脑微血管分离 15只小鼠在大理大学动物中心饲养1周，随机取8只给予30 mg/kg非诺贝特、另外7只给予10%的CMC混悬液10 mL/kg灌胃，均连续灌胃7 d。末次给药30 min后断颈处死小鼠，取脑组织，分离小鼠脑微血管，取新鲜脑组织去除脑膜，放入PBS 3 mL，于离心管中匀浆，4 ℃、2 000 g离心5 min，弃上清液，沉淀物用PBS混悬3 mL，在混悬液上方加入15%右旋糖苷(用pH值为7.4的PBS配制)5 mL，4 ℃、3 500 g离心35 min，沉淀物用冷PBS混悬，用孔径为40 μm的尼龙膜过滤，收集尼龙膜上方的成分，即为脑微血管。

1.4 BMEC与小鼠脑微血管组织内PPARα、SOD3的mRNA表达检测 采用RT-PCR技术。取收集的BMEC和小鼠脑微血管，按照RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒说明书提取tRNA、合成cDNA，用iQ SYBR Green试剂盒进行检测。反应体系50 μL，其中cDNA 2 μL、SYBR Green混合物25 μL、引物各0.5 μL、DEPC处理的水22 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，之后95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，35个循环。PPARα基因上游引物为5′-gcagctcgtacaggtcatca-3′、下游引物为5′-ctcttcatccccaagcgtag-3′，产物202 bp；SOD3基因上游引物5′-ctgggtgcagctctcttttc-3′、下游引物5′-acatgtctcggatccactcc-3′，产物184 bp；GAPDH基因上游引物5′-aactttggcattgtggaagg-3′、下游引物5′-acacattgggggtaggaaca-3′，产物223 bp；目的基因相对表达量计算用2-ΔΔCt法。

1.5 含SOD3启动子荧光素酶报告质粒的构建 调取网上数据库(http://genome.ucsc.edu/index.html)小鼠SOD3基因的启动子序列，设计引物如下，SOD3启动子克隆上游引物5′-caccagcttttcatctagga-3′，下游引物5′-taatgtccttatgaaaaccag-3′，产物1 419 bp；用小鼠的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物插入pGL4.10 Luciferase Reporter Vectors中，得到含SOD3启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL4 mSOD3。

1.6 含SOD3启动子PPRE结合序列的定点突变 在SOD3基因启动子序列的-511～-488碱基序列中，有PPAR的结合位点；序列为：5′-ggtgtggtagggggcAGGTaccca-3′，根据突变试剂盒说明书，设计引物SOD3启动子突变上游引物5′-ggtgtggtagggggcCTTAaccca-3′，下游引物5′-gtggtgtggtagggggcGAATacccaataaccat-3′，利用突变试剂盒，把AGGT突变为CTTA，插入pGL4 Luciferase Reporter Vectors中，得到PPRE序列突变的荧光素酶报告质粒pGL4 mu mSOD3。

1.7 BMEC中荧光素酶活性检测 采用荧光素酶活性检测法。将培养好的BMEC随机分为两部分，将荧光素酶报告质粒pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3分别与pGL4.74共转染细胞，严格按照Lipofectamine2000说明书进行操作。转染24 h，各取pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3转染的部分细胞用终浓度10 μg/mL的非诺贝特处理12 h，收集细胞检测荧光素酶活性，获得相应光密度值(OD值)。用pGL4 mSOD3或pGL4 mu mSOD3的OD值/pGL4.74的OD值作为启动子荧光素酶活性相对值。

2 结果

2.1 非诺贝特对BMEC、小鼠脑微血管组织PPARα mRNA表达的影响 经非诺贝特、DMSO处理的BMEC，其PPARα mRNA相对表达量分别为3.36±0.45、1.00±0.09；经非诺贝特、CMC处理的小鼠，其脑微血管组织PPARα mRNA相对表达量分别为2.10±0.67、1.00±0.10。非诺贝特处理后，BMEC细胞及小鼠脑微血管组织中PPARα mRNA表达均升高(P均<0.05)。

2.2 非诺贝特对BMEC、小鼠脑微血管组织SOD3 mRNA表达的影响 经非诺贝特、DMSO处理的BMEC，其SOD3 mRNA相对表达量分别为5.37±0.44、1.00±0.08；经非诺贝特、CMC处理的小鼠，其脑微血管组织SOD3 mRNA相对表达量分别为6.89±0.21、1.00±0.03。非诺贝特处理后，BMEC及小鼠脑微血管组织中SOD3 mRNA表达均升高(P均<0.05)。

2.3 非诺贝特对BMEC中荧光素酶活性的影响 转染pGL4 mSOD3 24 h，经非诺贝特处理、未经处理的BMEC荧光素酶活性相对值分别为4.58±0.13、1.00±0.03，经非诺贝特处理后细胞内pGL4 mSOD3的荧光素酶活性增强(P<0.05)；转染pGL4 mu mSOD3 24 h，经非诺贝特处理、未经处理的BMEC荧光素酶活性相对值分别为1.38±0.57、1.00±0.10，经非诺贝特处理后细胞内pGL4 mu mSOD3的荧光素酶活性变化不明显(P>0.05)。

3 讨论

贝特类药物包括非诺贝特、Clofibrate、Gemfibrozil和人工合成的Wy14634等，是PPARα的配体。研究发现，PPARα的配体非诺贝特、Clofibrate等除临床降脂作用外，在各种缺氧刺激的动物模型中具有神经保护作用，其机制与贝特类药物促进SOD的表达等抗氧化作用有关[6～8]。在体内，活性氧(ROS)主要来源于还原型辅酶Ⅱ，而ROS的清除主要依赖于SOD的降解作用[9]。有研究发现，在糖尿病、寄生虫感染、细菌感染、心血管疾病、吸烟等病理生理状态下，ROS水平升高[10～14]。Nozik-Grayck等[15]敲除小鼠平滑肌细胞的SOD3后，会加重慢性低氧性肺动脉高压；用非诺贝特预处理小鼠，缺血再灌注后，小鼠脑组织中的ROS水平降低，其部分机制是SOD3的表达及SOD活性升高，因此非诺贝特可能具有调节SOD表达的功能[4,5]；而在不同原因引起的肾脏损伤中，非诺贝特通过激活PPARα影响SOD的表达和活性以保护受损的肾脏组织[16～18]。在大鼠帕金森综合征动物模型中，非诺贝特可通过影响SOD、谷胱甘肽等的表达起到神经保护作用[19]。以上研究均说明非诺贝特通过影响SOD的表达以维持体内ROS的动态平衡，从而起保护作用，但具体调节机制仍然不清。

本研究用SOD3基因启动子序列构建的荧光素酶报告质粒转染BMEC，之后用非诺贝特刺激被转染的细胞，可导致其荧光素酶活性升高，表明非诺贝特以某种方式调节BMEC内SOD3的表达；而在细胞水平和动物水平研究发现，非诺贝特处理后，SOD3的表达升高，说明非诺贝特具有调控SOD3表达的能力；进一步研究发现，非诺贝特处理后，BMEC、小鼠脑微血管组织PPARα表达升高，说明非诺贝特调控SOD3的表达有可能通过激活PPARα实现的。为了进一步明确非诺贝特调控SOD3的表达是否依赖于非诺贝特激活PPARα的表达，本研究将SOD3基因启动子上PPRE结合序列进行突变后构建荧光素酶报告质粒，转染BMEC，检测荧光素酶活性，结果发现非诺贝特激活SOD3基因启动子活性的作用消失，进一步说明非诺贝特的调控作用依赖于激活的PPARα结合到SOD3基因启动子的PPRE区域以调节SOD3基因表达。SOD3基因表达升高可以促进ROS的降解以保护由于各种原因导致的ROS升高引起的损伤，从而解释了非诺贝特在研究中对诸如糖尿病引起的肾脏疾病[10,18]、慢性低氧性肺动脉高压[15]、脑缺血再灌注[4]等各种原因引起损伤的作用机制。

总之，本研究从基因表达调控水平阐明了非诺贝特的保护作用是通过激活PPARα的表达，激活的PPARα与SOD3基因起始密码子上游的基因启动子序列上的PPRE结合，以调节SOD3的表达。

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Effect of fenofibrate on SOD3 expression in human BMECs and mouse brain microvascular tissues

DUXiaoshan,YANGXitong,XUHongyang,CHENJianjie,WANGGuangming

(TheFirstAffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To investigate the regulating effect of fenofibrate, the agonist of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), on the superoxide dismutase 3 (SOD3) expression in human brain microvascular endothelial cells (BMECs) and mouse brain microvascular tissues as well as the possible mechanism. Methods The cultured BMECs were randomly divided into two groups, which were seperately treated with 10 μg/ml of fenofibrate and the same volume of DMSO for 12 h. Fifteen mice were divided into two groups, which were treated with 30 mg/kg fenofibrate and 10 mL/kg of 10% CMC by gavage for 7 days. The tRNA was extracted and the brain microvessel was isolated. The mRNA expression levels of PPARα and SOD3 were detected by RT-PCR. We constructed a luciferase reporter plasmid pGL4 mSOD3 containing SOD3 promoter. The luciferase reporter plasmid pGL4 mu mSOD3 mutated from PPRE sequence were obtained by using the mutagenesis kit. The BMECs were transfected with pGL4 mSOD3 and pGL4 mu mSOD3 for 24 h. The cells were treated with fenofibrate at a final concentration of 10 μg/mL for 12 h in order to measure the luciferase activity.Results The mRNA expression of PPARα and SOD3 was increased in the BMECs and brain microvessel after the treatment of fenofibrate (allP<0.05). The luciferase activity of pGL4 mSOD3 in BMECs treated with fenofibrate was enhanced after transfection of pGL4 mSOD3 for 24 h (P<0.05).The luciferase activity of BMECs treated with fenofibrate did not significantly change after transfection of pGL4 mu mSOD3 for 24 h (P>0.05).Conclusion The SOD3 expression in the human BMECs and mouse brain microvascular tissues is regulated by fenofibrate through activating PPARα.

fenofibrate; extracellular Cu/Zn superoxide dismutase; brain microvascular; brain microvascular endothelial cells

国家自然科学基金资助项目(81360206)；云南省中青年学术技术带头人后备人才基金项目(2014HB025)。

杜小珊(1990-)，女，在读硕士，主要研究方向为脑卒中的发病机制。E-mail：912096630@qq.com

王光明(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向为脑卒中的发病机制。E-mail：gmwang1991@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.002

R743

A

1002-266X(2017)05-0004-04

2016-11-04)