精浆弹性硬蛋白酶水平对IVF-ET正常受精、优质胚胎的影响

孙金龙，韩乐天，张楠，郭琼，连方，孙振高

(1山东中医药大学2014级博士研究生班，济南250011；2山东中医药大学附属医院；3山东省妇幼保健院)

精浆弹性硬蛋白酶水平对IVF-ET正常受精、优质胚胎的影响

孙金龙1，2，韩乐天2，张楠2，郭琼3，连方2，孙振高2

(1山东中医药大学2014级博士研究生班，济南250011；2山东中医药大学附属医院；3山东省妇幼保健院)

目的 探讨精浆弹性硬蛋白酶对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)正常受精、优质胚胎的影响。方法 选择因女方输卵管因素行促性腺激素释放激素激动剂长方案卵巢控制性刺激的1 183对周期不孕夫妇。按照男性生殖系统感染情况将女性分为三组：未感染(精浆弹性硬蛋白酶水平<290 ng/mL)组703例、隐性感染(精浆弹性硬蛋白酶水平290～1 000 ng/mL)组385例、确证感染(精浆弹性硬蛋白酶水平>1 000 ng/mL)组95例。排除获卵数≤5个或≥20个、女方年龄≥35岁，三组经校正后未感染组159例、隐性感染组137例、感染组41例。均行IVF-ET，对比各组校正前后正常受精率、优质胚胎率。结果 校正前三组正常受精率、优质胚胎率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。校正后三组正常受精率比较差异有统计学意义(P<0.05)，优质胚胎率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与隐性感染组、未感染组比较，感染组正常受精率降低(P<0.017)。结论 排除女方高龄、卵巢低反应及卵巢高反应人群，卵巢正常储备女性其丈夫精浆弹性硬蛋白酶水平对IVF-ET正常受精率有影响，对优质胚胎率影响不大。

体外受精；精浆弹性硬蛋白酶；胚胎移植；优质胚胎；男性；生殖系统感染

男性隐性生殖系统感染对男性生育力有潜在的负面影响。精浆弹性硬蛋白酶是诊断男性生殖系统感染，特别是隐性感染的重要指标之一。精浆弹性硬蛋白酶水平与精液中炎性细胞数呈正比[1]。炎性细胞可通过吞噬作用、产生活性氧(ROS)及分泌诸多细胞因子等方式损伤精子，破坏精子的正常功能和成熟过程。在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术发展过程中，男性精液的作用也越来越受到重视。本研究探讨精浆弹性硬蛋白酶水平对IVF-ET正常受精、优质胚胎的影响，以期发现男性生殖系统感染对IVF-ET结局的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年6月～2016年6月于山东中医药大学附属医院行IVF-ET的1 183对夫妇。女方年龄18～41岁，不孕年限2～7年，原发不孕555例、继发不孕628例，周期获卵数1～43枚，胚胎培养随机采用Irvine或Quinn′s培养液系统。纳入标准：①因女方输卵管因素行IVF-ET，排除男女双方泌尿生殖系统急性感染；②女方采用促性腺激素释放激素激动剂长方案卵巢控制性刺激并获得卵子；③男方精液常规检查无异常；④取卵前1～2个月，男性行精浆弹性硬蛋白酶检测。排除标准：①排卵障碍；②子宫内膜异位症及子宫腺肌病；③盆腔炎性疾病及其后遗症。按照男性生殖系统感染情况[2]将女性分为三组：未感染(精浆弹性硬蛋白酶水平<290 ng/mL)组703例、隐性感染(精浆弹性硬蛋白酶水平290～1 000 ng/mL)组385例、确证感染(精浆弹性硬蛋白酶水平>1 000 ng/mL)组95例。排除获卵数≤5个或≥20个、女方年龄≥35岁，三组经校正后未感染组159例、隐性感染组137例、感染组41例。各组临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。入组前均签署知情同意书，并经本院伦理委员会批准。

1.2 正常受精率、优质胚胎率测算 采用密度梯度离心+上游法处理精子。以人绒毛膜促性腺激素10 000 U扳机后36 h取卵，体外培养4 h，调整精子密度至每个微滴精子悬液50 μL，精子按5 000～10 000条/卵子进行调整，加入微滴与卵子共同培养16～18 h，在倒置显微镜下观察受精情况，以见到原核(PN)或卵裂为受精成功的标志。正常受精率=2PN受精卵/卵母细胞总数×100%；优质胚胎率(分裂球期胚胎)=(Ⅰ级胚胎数+Ⅱ级胚胎数)/卵裂数×100%[3]。胚胎分级标准参照《临床诊疗指南：辅助生殖技术与精子库分册》卵裂期胚胎评分系统[4]。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料三组比较使用多重比较列联表Pearsonχ2检验，P<0.05为差异有统计学意义；进一步两两比较采用四格表χ2检验，调整检验水准α=2×0.05/3×(3-1)=0.017，P<0.017为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组校正前正常受精率、优质胚胎率比较 未感染组、隐性感染组、确证感染组正常受精率分别为61.78%(5 070/8 206)、63.00%(2 668/4 235)、62.58%(654/1 045)，优质胚胎率分别为41.94%(1 712/4 082)、42.24%(890/2 107)、41.78%(216/517)；三组正常受精率、优质胚胎率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 三组校正后正常受精率、优质胚胎率比较 未感染组、隐性感染组、感染组正常受精率分别为75.53%(1 321/1 749)、70.07%(1 056/1 507)、48.78%(220/451)，优质胚胎率分别为56.32%(490/870)、54.98%(414/753)和55.51%(126/227)；三组校正后正常受精率比较差异有统计学意义(P<0.05)，优质胚胎率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与隐性感染组、未感染组比较，感染组正常受精率降低(P<0.017)。

3 讨论

精浆弹性硬蛋白酶是机体内能水解弹性蛋白的酶，分布于中性粒细胞、巨噬细胞等多种组织和细胞中。当存在男性生殖系统感染时，该酶被大量分泌至细胞外，与其他氧化物发挥局部抗炎性反应。由于弹性硬蛋白酶是一种可溶性蛋白酶，在精液中均匀分布，对诊断男性生殖系统感染比精浆白细胞更加准确。因此，精浆弹性硬蛋白酶是男性生殖系统感染，特别是隐性感染的重要诊断指标之一[5]。精浆弹性硬蛋白酶升高为确诊感染者，其白细胞总数、CD4+T淋巴细胞和单核-巨噬细胞数比未感染者增加[6]。由于其有效性和稳定性，该酶作为静止型生殖系统感染的诊断及预后监察指标，并得到WHO的推荐[2]。

精浆弹性硬蛋白酶升高导致正常受精率降低的原因有以下几个方面：①弹性硬蛋白酶与精子单链DNA呈负相关，单链DNA精子在IVF-ET技术中其受精能力较差[7,8]。②由精浆弹性硬蛋白酶提示的生殖系统感染时，炎性细胞可通过吞噬作用、产生ROS及分泌多种细胞因子等途径损伤精子的正常功能，包括正常的受精能力[9]。③精浆弹性硬蛋白酶水平升高可引起精子顶体酶活性的降低[10，11]，这其中的原因可能是由于炎性细胞及其产物引起的精子顶体膜被破损。而精子顶体酶活性降低与低受精率有关[12,13]。且有研究发现，对精液中白细胞>1×106/mL的且给予抗炎治疗有效者，其精子顶体酶活性也随之上升，再次证明精浆弹性硬蛋白酶可以影响精子顶体酶活性[14]。

本研究校正前未发现精浆弹性硬蛋白酶水平与体外受精率有差异。尽管文献报道的关于女性高龄、卵巢低反应与高反应对受精率的影响结论不一，但据我们临床观察以上几种情况可能导致受精率降低甚至完全不受精，文献中也有类似报道[15～17]。为进一步证实，本研究排除获卵数≤5个或≥20个、女方年龄≥35岁，对数据进行校正，结果发现确证感染组的正常受精率低于未感染组、隐性感染组，优质胚胎率未见明显差异；隐性感染组的正常受精率、优质胚胎率与未感染组比较差异无统计学意义，可能与IVF受精前精液的密度梯度离心+上游法处理有关。文献报道上游法筛选出的精子不仅具有较高的活力，具有完整顶体区域的椭圆形精子比例也相对增加[18]。同时，上游法还可显著降低影响精子活力的指标水平，如NO[19]。密度梯度离心法可将DNA断裂和染色体浓缩差的精子进行筛除，Erel等[20]认为，经密度梯度离心法处理后得到的精子顶体反应率、低渗肿胀实验阳性率和和成熟比例均比上游法显著提高。精液密度梯度离心+上游法结合应用，提高了精子回收率，在精液处理过程中通过分子筛的离心作用及洗涤，可以有效去除精浆及精液中不利于受精的成分，如前列腺素、异性蛋白、抗精子抗体及各种非精子细胞成分，从而可以为受精提供更有利的环境。研究提示，精液密度梯度离心+上游法处理除可提高精子活力外，还可降低畸形精子比例，从而提高体外受精成功率[21]。

IVF-ET技术的禁忌证已有明确规定，但男性非急性生殖系统感染并非为其禁忌证。为保证IVF-ET技术成功率，有必要对男性非急性生殖系统感染给予关注及治疗。常见的泌尿生殖道病原菌为非典型菌，无细胞壁的生理特性使内酰胺类及糖肽类抗生素治疗无效。抑制蛋白合成的抗生素治疗效果比较理想[22,23]。治疗期间应注意避免无保护性生活，症状明显或者明确检出病原菌的患者，应建议性伴侣同时规范治疗。

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B

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