重组纤连蛋白制备及其应用

纤连蛋白(fibronectin，Fn)是一种细胞外基质中的高相对分子质量糖蛋白，广泛参与细胞的多种生理活动，包括细胞的迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程。纤连蛋白还能调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，有利于伤口快速修复，具有生长因子作用。纤连蛋白也能显著提高DNA、RNA 及蛋白质合成速度，成为应用规模细胞培养技术生产新药品的基础物质。纤连蛋白应用广泛，但天然纤连蛋白产量极为有限，成本昂贵，限制了其应用；传统纤连蛋白生产工艺耗时长、提取流程复杂，且最终得率极低，也存在安全问题。

现阶段对重组类人蛋白的研究与日俱増，对重组类人纤连蛋白的研宄也越来越多，已有研究者成功生产了自主研发的产品并展开基础和临床的应用。 中国专利CN202211088313.8 公开了一种重组人源纤连蛋白制备及其在毕赤酵母中的表达方法。所述的重组人源纤连蛋白是将人源纤连蛋白中与胶原蛋白和细胞整合素结合的功能区域进行理性设计优化后所得，包含1 个胶原蛋白结合区域和2 个重复的细胞整合素协同结合区域。 所述的重组人源纤连蛋白是高拷贝重组菌株将重组人源纤连蛋白序列转化到毕赤酵母中，并经G418 抗性梯度筛选获得。 该重组人源纤连蛋白在护肤品和医药领域具有广泛的应用前景。CN201910891483.1 公开了一种密码子优化的重组纤连蛋白基因， 通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。 该发明中利用毕赤酵母作为表达宿主细胞，可以解决人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术缺陷。 CN201910281043.4 公开了一种巴斯德毕赤酵母及其应用。 所述的巴斯德毕赤酵母的保藏编号为CCTCC NO:M 2016763。 该发明中巴斯德毕赤酵母菌株的多肽表达量与现有技术中的同种菌株相比有大幅提高，提高幅度可达36.32%。 另外，巴斯德毕赤酵母的表达产物对于紧密连接蛋白ZO-1、层粘连蛋白和纤连蛋白的表达量具有明显的增强作用，可作为紧密连接蛋白ZO-1、层粘连蛋白和纤连蛋白的基因表达上调剂。CN201910388775.3 公开了一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，包括至少一个钠钾ATP 酶β 亚基结合域，该发明还公开了该酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的制备方法以及应用。 酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽能够有效被皮肤吸收， 对创伤型皮损或角质完整的皮下损伤有优秀的愈合和修复作用。CN202010116877.2 公开了一种重组人纤连蛋白制备方法和应用。 根据密码子表达偏好性先优化了目的基因片段， 再将所得的基因片段插入pET32a 中构建重组质粒； 将该重组质粒转化导入表达载体BL21(DE3)中，经筛选得到了能高效表达的阳性克隆菌；再将阳性克隆菌经放大发酵培养后诱导表达，再将破碎、离心得到的上清液经亲和层析柱洗脱、透析、过滤步骤纯化后，得到蛋白质质量浓度高达1.0 mg/mL 以上，纯度大于90%的rhFNⅢ1-C 优质蛋白质溶液。通过促细胞黏附性实验检测观察，显示rhFNⅢ1-C 具有明显促进MDBK 细胞和Balb/c/3T3 细胞贴壁、黏附和细胞快速分裂生长的性能，表明该蛋白质具有作为药妆医美护肤原料和成品的巨大潜力。 CN202210844025.4 公开了一种重组纤连蛋白突变体及其应用，通过对重组纤连蛋白突变体的核苷酸序列进行优化， 通过部分片段的重复， 可以更有效地促进细胞增殖活性及黏附活性。CN202111056589.3 涉及一种复合透皮重组纤连蛋白及其应用。 该复合透皮重组纤连蛋白包括透皮短肽、纤连蛋白和胶原蛋白顺次连接的融合多肽，能有效解决现有纤连蛋白存在的透皮能力低、细胞黏附差、伸展及生长能力差的技术问题。 CN202010438531.4 涉及具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD 结构域、至少一段可作用于钠离子通道的结合肽段，所述RGD 结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0~300 个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接，同时具有结合钠离子通道以及整合素受体的能力，具有促进皮肤修复、代谢更新、增强淡斑、减少皱纹的效果，其采用高密度发酵、超耐受金属亲和层析纯化、特异性蛋白酶切除标签、离子柱精制纯化方法，得到的重组纤连蛋白rFN 不含纯化标签、纯度高、比活力高，制备过程简单高效、低成本、适合大规模生产。

随着人们对重组纤连蛋白应用效果认可度的提高和产品需求量的增长，相信相关的研究会不断向前推进。 如研究纤连蛋白功能域片段设计与优化、纤连蛋白表达载体构建与筛选，以及纤连蛋白的分离纯化、结构与功能分析、产业化生产等技术，开发多功能的重组纤连蛋白，在未来会有更好的发展前景。