胃癌铁死亡的研究进展

陈堯 综述 黄海舸 审校

1.右江民族医学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000

在我国消化道肿瘤的临床工作和分子生物研究领域中，胃癌一直是研究热点，因其早期病情不明显，大部分患者就诊时已为中晚期胃癌，治疗难度大、效果差、费用高，五年生存率仅20%[1-2]，亟需探索新的治疗策略。而铁死亡作为近年来兴起的一种新型细胞死亡形式，已被发现可影响胃癌增殖、转移、侵袭、耐药等生物学行为，诱导胃癌细胞铁死亡成为一个新的研究方向，以后可能会成为胃癌新的治疗手段。本文就近年来国内外在胃癌铁死亡领域的研究进行综述。

1 铁死亡的概念

铁死亡即铁依赖的由活性氧(ROS)累积和多不饱和脂肪酸(PUFA)消耗所引起的细胞死亡形式，是近年来发现的一种新型的细胞程序性死亡方式，区别于细胞凋亡、自噬、焦亡、坏死等[3-4]。该概念最早为2012年由Βrent R.Stockwell团队提出[5]。

2 铁死亡的代谢基础

铁的累积与脂质过氧化是铁死亡主要的两个生化特征。铁是人体中一种重要的微量元素，铁缺乏或铁过载都会影响正常的生理机能[6]。细胞内过量的Fe2+能通过芬顿反应产生ROS 以及激活含铁的酶(如脂氧合酶)来促进脂质过氧化过程，铁依赖的脂质过氧化是铁死亡的标志，该过程是一种由ROS驱动的脂类氧化降解的连锁反应，其核心步骤为ROS从细胞膜的脂质中夺取电子致其发生过氧化，因此脂质发生过氧化的倾向取决于其中碳氢键的强度，这决定了PUFA对氧化损伤高度敏感的特性，PUFA 被激活后会掺入细胞膜脂质双分子层，一旦PUFA发生过氧化，将对胞膜的完整性造成致命性影响，即导致细胞膜脂质双分子层结构破坏，引发细胞铁死亡[7]。

此外，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 是促进PUFA过氧化过程的两个主要酶。在ACSL4 的催化下，PUFA 发生过氧化，铁死亡代谢产物丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯醛增加[8]。

3 铁死亡在胃癌中的调控机制

3.1 GPX4 和系统Xc-胱氨酸-GSH-GPX4 是最经典的铁死亡调控机制。谷胱甘肽(GSH)是细胞中一种重要的抗氧化物质，其主要合成原料为胱氨酸，胱氨酸的摄取需依靠广泛存在于磷脂双分子层中的系统xc-，系统xc-由胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(SLC7A11，xCT)和SLC3A2 两个亚基组成，胞外的胱氨酸通过SLC7A11与胞内的谷氨酸进行交换，转移至胞内参与GSH 的合成。而GPX4 是一种GSH 依赖性的酶，它能使还原型GSH向氧化型GSH转变，并能还原各种过氧化物，消除脂质ROS，从而抑制铁死亡。因此GSH的消耗会引起GPX4 的活性降低，从而引起脂肪过氧化物的积累，进而引发铁死亡[9]。可见SLC7A11 是铁死亡的关键抑制因子，其积累会增加GSH 的水平并抑制细胞中ROS 和铁的积累，从而使细胞抵抗铁死亡[10]。Erastin 和RSL3 是两种经典的铁死亡诱导剂。Erastin可抑制SLC7A11，阻止系统xc-摄取胱氨酸导致半胱氨酸和GSH的消耗，导致ROS的积累诱导铁死亡[11]。RSL3的分子靶标是GPX4，与GPX4活性位点的硒代半胱氨酸共价结合，不可逆地抑制其酶活性[12]。可见胱氨酸-GSH-GPX4 代谢途径在铁死亡中拥有着核心地位，通过各种手段干预系统xc-、GSH或GPX4 调控胃癌铁死亡也是最常见的研究思路，如使用6-硫鸟嘌呤可直接降低胃癌细胞GSH水平，下调GPX4表达，增加ROS水平，从而触发Fe2+诱导的铁死亡，抑制瘤体生长[13]；3,3'-二吲哚甲烷通过ΒAP1-IP3R轴降低GPX4 及系统xc-的表达，诱导铁死亡发挥抗癌作用[14]；纳米颗粒-谷胱甘肽响应性二氧化硫聚合物前体mPEG-PLG可以自行组装形成纳米颗粒，消耗GSH和释放SO2选择性地加速脂质过氧化诱导癌细胞发生铁死亡，表现出有效的抗胃癌活性[15]等。并在此基础上发现了越来越多的铁死亡调控基因，如核因子红系2相关因子2(NRF2)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)等。

3.1.1 NRF2 NRF2 是抗氧化反应的重要调节因子，可以抵抗和预防氧化应激反应，在胃癌脂质过氧化、铁死亡中发挥着一定的作用，其水平受Keap1和p62 介导的蛋白酶体降解的调节[16]，且基因转录部分受ROS控制，因此，目前胃癌铁死亡对NRF2的研究大多涉及p62-Keap1-NRF2 轴。如Wang 等[17]的研究发现，抑制LTΒP2可调节p62-Keap1-Nrf2通路下调xCT的表达，降低胃癌细胞GSH水平，降低GPX4活性，增加ROS 生成，导致胃癌细胞铁死亡，显著抑制胃癌细胞增殖。Fu 等[18]发现过表达ATF3 后，顺铂耐药胃癌细胞株对顺铂恢复了敏感性，其机制为ATF3 对Nrf2/Keap1/xCT 信号通路的抑制，促进胃癌细胞发生铁死亡，降低其对顺铂的耐药性。上皮-间质转化(EMT)是癌细胞转移的先决条件，Guan等[19]的研究发现，2,2-二吡啶酮腙二硫代氨基甲酸丁酸酯可通过诱导胃癌细胞发生铁死亡，抑制胃癌细胞的EMT 转化，发挥抗肿瘤活性，其机制与Keap1 降解→Nrf2 激活→HO1 上调所导致的Gpx4 和xCT 消耗有关。SIRT6 是NAD (+)依赖性蛋白去乙酰化酶sirtuin 家族的成员，与细胞活性、氧化应激、抗衰老等相关。Cai等[20]的研究发现，沉默SIRT6 的表达可促进胃癌细胞发生铁死亡，克服其对索拉非尼的耐药性，其机制为SIRT6 表达下调后导致的Keap1/Nrf2 信号通路失活和GPX4 下调。可见Nrf2 能在调控GPX4 的基础上参与胃癌的铁死亡代谢，影响其增殖、迁移和耐药的生物学行为。

3.1.2 HIF-1α腹膜转移是胃癌远处转移的主要部位，预后和生存率极差。缺氧是腹膜转移的共同特征，HIF-1α的上调可能是腹膜转移发生的潜在驱动因素。Lin等[21]的生物信息学分析结果表明，腹膜转移相关长链非编码RNA(PMAN)在胃癌腹膜转移中高表达，且其表达水平与腹膜转移的发生及预后不良呈正相关。进一步的体外实验发现PMAN 受到HIF-1α的显著调节，表现为PMAN 在缺氧期间被HIF-1α激活而表达上调，而PMAN则可以通过直接结合的方式诱导ELAVL1胞质易位，增加SLC7A11 mRNA的稳定性，降低胃癌细胞中总铁、亚铁、脂质ROS、谷胱甘肽二硫化物与GSH 的比率和MDA 的细胞内浓度，促进了胃癌细胞对铁死亡的抵抗力，抑制胃癌细胞中的铁死亡，最终促进胃癌腹膜转移。阐明HIF-1α/PMAN/ELAVL1在胃癌细胞铁死亡中的作用可为胃癌中腹膜转移的潜在诊断生物标志物和治疗靶点提供理论支持。无独有偶，Li等[22]发现敲低瞬时受体电位离子通道亚家族M 成员2 (TRPM2)可降低胃癌细胞HIF-1α、系统xc-、GPX4的水平，促进胃癌细胞铁死亡，抑制胃癌细胞活力、迁移和侵袭能力，且能够增强Erastin和RSL3 对胃癌细胞铁死亡的诱导效果。而激活HIF-1α可逆转TRPM2起到的调节GSH 浓度、GPX4 活性、Fe2+浓度、ROS 水平和脂质过氧化的作用，显著抑制敲除TRPM2 的胃癌细胞对Erastin 和RSL3 的敏感性，消除Erastin 和RSL3 对细胞迁移、侵袭和克隆原性的抑制。说明沉默TRPM2可通过降低HIF-1α促进胃癌铁死亡。

3.1.3 STAT3 STAT3是胃癌的致癌基因。丙泊酚是一种应用广泛的麻醉药物，Liu 等[23]发现，丙泊酚可上调miR-125b-5p，靶向抑制STAT3的表达，且经丙泊酚处理后胃癌细胞的GSH 水平降低，SLC7A11、GPX4表达受抑制，进而增强了胃癌细胞的铁死亡，抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移。而miR-125b-5p 抑制剂或STAT3 过表达可逆转异丙酚减弱的胃癌细胞恶性表型。说明丙泊酚/miR-125b-5p/STAT3 轴可诱导胃癌细胞铁死亡并抑制其恶性表型。但较为遗憾的是作者并未深究丙泊酚/miR-125b-5p/STAT3 轴与GSH、SLC7A11、GPX4 所存在的具体靶向关系。铁蛋白重链1(FTH1)是铁储存蛋白复合物(也称为铁蛋白)的重要成员，可防止Fe2+被ROS 氧化，其与SLC7A11及GPX4都是铁死亡抑制基因。Ouyang等[24]的研究证明了STAT3 可与胃癌细胞中FTH1、SLC7A11、GPX4三个基因的启动子结合，介导其反式激活。而敲低STAT3则会引起这三个基因转录水平显著下降，触发铁依赖性氧化损伤并抑制胃癌的增殖和存活。使用STAT3 抑制剂W1131 可通过上述机制减轻胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性。至此STAT3 通过SLC7A11及GPX4调控胃癌铁死亡影响其增殖、侵袭、迁移和耐药特性的机制被阐明。

3.1.4 硬脂酰辅酶A 去饱和酶1(SCD1) SCD1是一种参与饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的关键酶，可加速多种癌症的发生。Wang 等[25]的研究表明，SCD1 增强了SLC7A11和GPX4 的表达，防止胃癌细胞发生铁死亡，增强其细胞增殖和集落形成能力，且能加速胃癌异种移植小鼠模型中肿瘤的生长；且外源性过表达SCD1 使EMT 标志物(N-钙黏蛋白、波形蛋白、α-SMA 和Twist1)和细胞运动标志物Arpc3 升高，显著增强了胃癌细胞的迁移活性。癌症干细胞是肿瘤复发和耐药的重要原因，Zhang 等[26]发现SCD1在调节胃癌干细胞(GCSC)中的脂质代谢和铁死亡中起关键作用，体内和体外实验数据表明，顺铂和紫杉醇可通过上调异质核核糖核蛋白A1(hnRNPA1)的表达诱导胃癌细胞分泌外泌体lncFERO(exo-lncFERO)，后者可直接与SCD1 mRNA相互作用来促进SCD1 的表达而进一步使PUFA 水平失调，导致GCSC 中铁死亡被抑制，增强细胞干性并使其获得化疗耐药。可见SCD1 不仅能影响SLC7A11 和GPX4 表达，使胃癌细胞免于铁死亡，增强其增殖、迁移的能力，还可以通过打乱不饱和脂肪酸的平衡赋予胃癌细胞耐药特性。

3.2 不饱和脂肪酸 ROS 介导的PUFA 过氧化是铁死亡的核心过程，而ACSL4 作为PUFA过氧化过程的关键酶，调节其表达可影响铁死亡，如益气化瘀汤可通过抑制ACSL4 表达干预PUFA过氧化过程，起到抵抗胃癌复发、转移的作用[27]。此外，单不饱和脂肪酸(MUFA)可间接影响PUFA 的作用来调控铁死亡，MUFA可以通过阻止ROS的积累并减少PUFA与磷脂的结合，该过程又需要通过ACSL4同家族的另一位成员酰基辅酶A合成酶长链家族成员3 (ACSL3)的激活[28-29]。Ma等[30]发现MAT2A 可通过上调ACSL3 表达，赋予胃癌细胞铁死亡抗性，MAT2A 的敲低使胃癌细胞对Erastin 和RSL3 两种铁死亡抑制剂敏感，且抑制MAT2A增强了顺铂的抗肿瘤活性。

4 铁死亡在胃癌中扮演的角色

4.1 铁死亡与胃癌的增殖、转移、侵袭 通过各种手段直接作用于胱氨酸-GSH-GPX4 途径，或通过干预系统xc-影响胱氨酸-GSH-GPX4 原料进入细胞，以影响胃癌细胞的铁死亡代谢可达到干预其增殖、转移、侵袭等生物学行为的效果。Liu等[31]设计合成的冬凌草甲素衍生物能降低GPX4 的表达，诱导铁死亡以抑制胃癌细胞生长，且过表达GPX4 可拮抗其抗胃癌细胞增殖活性，在来自不同患者的胃癌异种移植小鼠模型中，冬凌草甲素衍生物能表现出比5-氟尿嘧啶更有效的抗癌活性。Zhang 等[32]的研究发现，经麦冬皂苷Β (OP-Β)处理后的AGS 和NCI-N87 胃癌细胞株GPX4 和系统xc-的表达降低，Fe2+、ROS、MDA 含量增加，显著诱导了胃癌细胞的死亡。同时在动物实验中确定了OP-Β可显著抑制小鼠胃癌异种移植肿瘤的生长，且癌组织GPX4 和系统xc-的表达变化与细胞实验结果一致。Ni等[33]则通过过表达miR-375而靶向沉默SLC7A11，使得胃癌细胞中半胱氨酸和GSH 水平降低，脂质ROS水平增加，镜下表现出线粒体变小、膜密度随着退化嵴而增加等铁死亡特征，并发现瘤体的聚集速度、胃癌干细胞出现的频率及癌细胞转移能力下降，说明过表达miR-375可通过铁死亡抑制胃癌细胞的干性。

4.2 铁死亡与胃癌的耐药 化疗耐药是胃癌临床疗效的最重要障碍，现有的研究表明，通过调节胃癌铁死亡代谢，可改变胃癌细胞的耐药性，恢复其对多种化疗药物的敏感性。Ni等[34]发现丹参酮ⅡA可增加脂质过氧化物的水平，降低GSH水平，诱导铁死亡，降低GCSC 球体形成能力，其机制为丹参酮ⅡA 通过SLC7A11 显著降低了GCSC 干性标记物OCT3/4、ALDH1A1 的表达水平，降低了GCSC 的化学抗性。Wang等[35]的研究发现，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活减少了胃癌细胞ROS 的产生，赋予其铁死亡抗性，具体机制为β-catenin/TCF4 转录复合物直接与GPX4 的启动子区域结合诱导其表达；进一步的实验表明TCF4 缺乏可促进顺铂诱导的铁死亡，增强了胃癌细胞的化学敏感性。Zhao等[36]的研究发现，固醇调节元件结合蛋白-1a(SREΒP-1a)可通过与GPX4 启动子区域结合直接激活GPX4转录，而阿帕替尼可通过下调活化的SREΒP-1a 蛋白水平，下调GPX4 表达，进而诱导顺铂、5-FU多重耐药的胃癌细胞发生铁死亡，使耐药细胞对化疗药物恢复敏感，逆转其多重耐药性。脂氧合酶与脂质-ROS的产生密切相关，Zhang等[37]的研究发现，顺铂和紫杉醇通过激活USP7/hnRNPA1轴促进癌症相关成纤维细胞分泌外泌体，外泌体中的miR-522 可靶向抑制花生四烯酸脂氧合酶15，阻断ROS 积累，从而抑制胃癌细胞铁死亡，降低其化疗敏感性。ADP 核糖基化因子6(ARF6)是大鼠肉瘤病毒超家族的成员，可参与调节囊泡运输、膜脂重塑和信号通路。Geng 等[38]发现，沉默ARF6 的表达会增加胃癌细胞GPX4 蛋白和mRNA 的水平，同时可提高卡培他滨诱导的MDA浓度的增加，增加胃癌对卡培他滨的敏感性，进一步的研究发现，沉默ARF6显著降低了卡培他滨耐药相关的代谢蛋白：二氢嘧啶脱氢酶和胸苷酸合酶的水平，说明ARF6可以通过多种途径控制卡培他滨耐药性，虽然其并不完全是由于铁死亡的激活。

综上所述，现阶段界内学者的研究成果通过不同的手段干预GPX4 介导的铁死亡，可恢复或增强耐药株对顺铂、5-FU、紫杉醇及卡培他滨等化疗药的敏感性，而众所周知，顺铂、5-FU、紫杉醇及卡培他滨属于不同类型的化疗药物，其发挥抗癌作用的机制各不相同，但通过GPX4 介导的铁死亡可恢复耐药菌对这些药物的敏感性，难道说GPX4介导的铁死亡，对所有类型的化疗药物耐药均有效？这是个胆大的猜想，同样也是笔者的疑惑之处。难道铁死亡真的有如此神乎其神的强大作用？这或许有待更严谨的探究，回顾这些研究笔者发现，所谓的恢复化疗敏感性也只不过是肿瘤细胞增殖能力降低、迁移能力下降、死亡数量增加亦或是GCSC 干细胞标志物下调这一表象，这是否只是对化疗作用与铁死亡作用“1+1=2＞1”表象所产生的想当然的臆想？换句话说，铁死亡有没有可能只是独立于化疗效果“1”而存在的另外一个“1”？若这些疑问有幸能被有力的证据解答，或许会对胃癌甚至是其他任何一种癌症的治疗再添上一道保险。

5 展望

近年来的这些研究成果表明铁死亡的确是调控胃癌生物学行为的关键机制之一，加之胃是铁吸收、贮存的主要脏器，铁的代谢也是胃癌铁死亡代谢的重要一环，人为诱发胃癌铁死亡可能会减缓胃癌进展、减少化疗耐药，且早期发现和纠正铁过载也可能有助于胃癌的临床治疗。因此，利用好铁死亡进行靶向治疗具有良好的前景。然而，虽然界内对胃癌铁死亡的研究已进入白热化阶段，但目前真正能把铁死亡应用于胃癌临床治疗的研究极少，笔者认为可能是存在以下几个难点，首先是沉默或过表达铁死亡调控基因能否在人体实现？局部或全身基因表达的改变是否会对人体其他正常功能产生影响？这可能是界内学者们最大的顾虑。其次是能否开发出与目前已阐明机制相对应的诱导铁死亡的药物并用于临床？最后，如果真的有幸能开发出新药，那么有效剂量的铁死亡诱导药物应用于人体是否有副作用？有哪些副作用？如何才能将这些副作用降到最低？对这些难点的突破任重而道远，需要进一步的努力。