独活寄生汤对膝骨关节炎模型大鼠NF-κB 通路关键分子表达的影响∗

张 锐，马继海，柴喜平，李爱强，柳海平

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是软骨退行性改变的慢性、退行性关节疾病，以关节内滑膜、软骨、软骨下骨及关节周围肌肉、韧带等结构损伤为主要病理变化［1］。KOA 多见于中老年人及运动员等人群，65 岁以上人群发病率高达60%，而肥胖患者更易出现，该病常迁延不愈，在疾病后期会发生步行障碍、关节畸形等［2］。现代医学关于该病的发病机制尚未完全阐明，临床用药虽能延缓疾病进展，但并无特效疗法阻止该病发生发展［3］。近年来中医药防治KOA疗效确切，且具有优势［4］。因此，本研究基于中医“滋补肝肾”理论，结合核因子核因子κB（nuclear factorkappaB，NF-κB）通路的分子生物学理论背景，建立白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）介导NF-κB信号通路在肝肾亏虚KOA 软骨微环境中的级联响应及独活寄生汤干预效应的可能机制”工作假说，为临床应用独活寄生汤治疗KOA 提供了可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择健康SPF 级Wistar 大鼠60只，雌雄各半，体质量（160±20）g，均购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物设施使用证明：00000230，实验动物合格证号：62001000001412。饲养条件：适应性喂养3 天，自由进食水，采用每12 h 明暗交替进行，湿度控制在40%～70%之间，温度控制在20～25 ℃，日温差≤4 ℃，氨浓度＜l5 mg/m3，噪音≤60 dB。动物实验遵守实验动物福利伦理审查指南。

1.2 药物及试剂独活寄生汤药物组成：独活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药、干地黄各6 g。由甘肃省中医院制剂室加工，常法煎煮后滤出药液加热浓缩至每1 mL 药液含生药1 g，使用时稀释至所需浓度。将硫酸氨基葡萄糖制成0.3 g/kg 备用试药，均置于4 ℃冰箱以备灌胃使用。IL-4 Elisa 试剂盒（批号：1803K7110）、IL-6 Elisa 试剂盒（批号：1803K1527）、IL-10 Elisa试剂盒（批号：1803K4365）、TNF-α Elisa 试剂盒（批号：1803K2573）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：20181343）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（批号：20181363）、抗NF-κB p65 及p-NF-κB p65（批号：20181407）多克隆抗体均由北京索莱宝有限公司生产；GAPDH（批号：ZS-257693）、山羊抗兔IgG/辣根酶标记（批号：152231）均由北京中杉金桥生物技术有限公司生产；ECL 显色试剂（美国 Millipore 公司，批号：19174233）。

1.3 实验仪器9U-ND25-2 型OLYMPUS 荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司）、MA-6000 型基因扩增仪（苏州雅睿生物有限公司）；DNM-9602 型酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）；PowerPoc Basic凝胶电泳仪（美国Bio-rad 公司）、Chemi-DocTMXRS+凝胶成像分析仪（美国Bio-rad公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模 将60 只SPF 级Wistar 大鼠适应性饲养3 天后分为空白组（10 只）和造模组（50 只）。造模组大鼠适应性喂养3 天后，氯胺酮按照0.1 g/kg 的剂量腹腔注射，麻醉显效后，使用1 mL 注射器向大鼠右膝关节腔注射4%的木瓜蛋白酶生理盐水溶液，注射量0.25 mL/kg，每隔7天注射1次，连续注射3次造模成功。造模成功表现：造模组大鼠关节处皮肤颜色发红、明显肿胀，行走或活动时造模肢体屈伸困难，常有保护性反射；病理观察见软骨细胞增生，滑膜细胞增多，细胞大量聚集、排列紊乱。模型制备成功后按随机数字表法分为模型组，硫酸氨基葡萄糖组（阳性组），独活寄生汤高、中、低剂量组，共5组，每组10只。

1.4.2 给药方法 独活寄生汤组及阳性组给药剂量均按70 kg 成人和大鼠体表面积折算的等效剂量，各药物干预组分别给予制备的药物水溶液等体积灌胃，空白组及模型组大鼠给予等体积灌胃生理盐水，每次2 mL，每日1 次，连续灌胃21天，第21天进行标本采集。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况 观察各组大鼠一般生存状况主要包括大鼠活跃性，毛发光泽饮食等情况。

1.5.2 大鼠软骨组织病理变化 采用苏木精-伊红染色法（HE）法观察各组大鼠软骨组织病理变化。

1.5.3 炎症因子水平 采用酶联免疫吸附法检测软骨组织及血清IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α水平。

1.5.4 炎症因子mRNA 表达水平 采用荧光定量PCR 法检测各组大鼠软骨组织中IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及NF-κB p65 的mRNA表达水平。

1.5.5 NF-κB p65及p-NF-κB p65的蛋白表达水平 采用蛋白质印迹法检测各组软骨组织NF-κB p65及p-NF-κB p65的蛋白表达水平。

1.6 统计学方法数据使用SPSS 21.0 统计软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，采用Bonferroni法；方差不齐，采用Tamhane´s T2法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般生存状况空白组大鼠活跃，毛发整齐光泽，饮食饮水正常，活跃易动；与空白组比较，模型组大鼠精神萎靡，毛发凌乱，饮食饮水较少；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组精神状态较好，毛发饮食等恢复正常；独活寄生汤高剂量和阳性组效果较好接近空白组，低剂量组和模型组比较一般生存状况无明显差异。

2.2 大鼠血清lL-4、lL-6、lL-10及TNF-α水平与空白组比较，模型组IL-4、IL-6及TNF-α水平均升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组、阳性组IL-4、IL-6 及TNF-α 水平均降低（P＜0.05）；与模型组比较，独活寄生汤高剂量组、阳性组IL-10水平升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清lL-4、lL-6、lL-10及TNF-α水平比较（±s） pg/mL

表1 各组大鼠血清lL-4、lL-6、lL-10及TNF-α水平比较（±s） pg/mL

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与空白组比较，P＜0.01

组别空白组模型组阳性组独活寄生汤低剂量组独活寄生汤中剂量组独活寄生汤高剂量组TNF-α 4.65±0.96 13.84±3.57#5.02±0.88*10.51±2.69*8.79±1.56*5.17±1.09*鼠数10 10 10 10 10 10 IL-4 2.08±0.05 14.42±3.68#4.61±0.77*10.29±2.54*6.93±1.89*5.22±0.91*IL-6 6.76±1.53 13.96±3.27#7.44±1.61*12.85±2.67*10.29±1.84*8.56±1.93*IL-10 10.23±2.37 3.55±0.86#8.19±1.74*4.68±1.17 5.16±1.44 7.84±1.56*

2.3 大鼠软骨组织lL-4、lL-6、lL-10、TNF-α 及NF-κB p65 的mRNA 表达水平与空白组比较，模型组IL-4、IL-6、TNF-α 及NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05），IL-10 水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，独活寄生汤中、高剂量组，阳性组IL-4、IL-6、TNF-α 及NF-κB p65 水平均降低（P＜0.05）；与模型组比较，独活寄生汤中、高剂量组，阳性组IL-10水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠lL-4、lL-6、lL-10、TNF-α、NF-κB p65 mRNA及NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠lL-4、lL-6、lL-10、TNF-α、NF-κB p65 mRNA及NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达比较（±s）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与空白组比较，P＜0.01

组别空白组模型组阳性组独活寄生汤低剂量组独活寄生汤中剂量组独活寄生汤高剂量组鼠数10 10 10 10 IL-4 mRNA 5.36±0.77 10.79±1.62#6.24±0.81*9.87±1.34 IL-6 mRNA 5.07±0.65 12.34±2.02#6.59±0.93*9.69±1.70 IL-10 mRNA 5.97±0.61 1.26±0.05#4.33±0.46*1.79±0.06 TNF-αmRNA 5.21±0.79 14.07±3.11#7.87±1.04*12.53±2.86 NF-κB p65 mRNA 5.44±0.65 11.06±1.43#6.15±0.87*10.58±1.02 NF-κB p65蛋白1.83±0.18 4.87±0.25#2.25±0.21*3.77±0.31**p-NF-κB p65蛋白0.76±0.08 2.64±0.22##1.17±0.14**2.04±0.17**10 8.15±0.96*7.83±0.92*2.53±0.11*9.04±1.38*8.97±0.72*3.02±0.29*1.56±0.12**1.21±0.13**10 7.22±0.75*7.04±0.87*3.45±0.17*8.16±1.27*7.31±0.68*2.97±0.28*

2.4 大鼠软骨组织NF-κB p65及p-NF-κB p65的蛋白表达与空白组比较，模型组NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组、阳性组NF-κB p65及p-NF-κB p65水平均降低（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 各组大鼠NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表达电泳图

2.5 大鼠软骨组织HE 染色结果空白组大鼠软骨组织各层细胞排列均匀、整齐，结构清晰完整，表面光滑，软骨基质着色均匀，潮线完整；模型组大鼠软骨组织细胞排列紊乱，结构不清，表面粗糙，基质着色不均匀；与模型组比较，阳性组和独活寄生汤各剂量组大鼠软骨组织结构较完整、清晰，表面较光滑，软骨基质着色较均匀。见图2。

图2 各组大鼠软骨组织病理图（HE，×100）

3 讨论

中医将膝骨关节炎归属于“骨痹”“膝痛”“痹证”等范畴。《素问·阴阳应象大论篇》曰：“肝生筋”，认为若肝血不足，则筋失濡养，动则易疲，拘急不利，可致肢体关节僵硬、屈伸不利等［5］。《类学·卷十八》曰：“筋虽主于肝，而维络关节以立保身者，唯膝之筋为最，故膝为筋之府。”认为筋的濡养与肝密不可分，当肝脏疏泄正常，方能气血对调，输布血液到经筋，维持筋的正常生理活动，指出KOA 的发生病在关节，与筋密切相关［6］。《素问·六节藏象论篇》曰：“肾者，主蛰，封藏之本，精之均也。”肾脏为藏精之所，肾精足则肾气充，方可推动和调控机体精气血津液的新陈代谢及能量的相互转化，肾气充，肾精足，则骨髓化生有源，骨骼健壮，筋骨坚利，关节不易退变，活动自如，若肾精不足，则骨骼失养，可致骨软无力、骨质脆弱、折损，屈伸不利等［7］。可见，肾在KOA的发生发展中起到重要作用，故该病主要病机责之于肝肾之虚，治疗则以祛风胜湿、滋补肝肾为法，常用独活寄生汤加减治疗。

独活寄生汤出自《备急千金要方》，具有滋补肝肾，祛风止痛之功。方中重用独活为君，辛苦微温，善治伏风，除久痹，且性善下行，可祛下焦与筋骨间的风寒湿邪。臣以细辛、防风、秦艽、桂心，细辛长于搜阴经之风寒湿邪，又除经络留湿；秦艽祛风湿，舒筋络而利关节；桂心温经散寒，通利血脉；防风祛一身之风而胜湿，君臣相伍，共祛风寒湿邪。佐以桑寄生、杜仲、牛膝以补益肝肾而强壮筋骨，且桑寄生兼祛风湿，牛膝尚能活血以通利肢节筋脉；当归、川芎、地黄、芍药养血和血，人参、茯苓、甘草健脾益气。以上诸药合用，具有补肝肾、益气血之功。研究表明，运用独活寄生汤治疗KOA 疗效显著［8-9］，但独活寄生汤是通过何种方式抑制膝骨关节病变的机制尚不明确，因此积极开展独活寄生汤防治KOA 相关研究，具有广阔的开发和应用前景。

研究发现，当机体长期处于非可控性炎症状态时，可发生炎症的级联反应，其机制与NF-κB 信号通路活化关系密切［10］，而KOA 作为具有慢性炎性反应特征的疾病，与NF-κB 信号通路活化及其下游分子的表达密切相关［11］。有学者研究发现，TNF-α、IL-6 等因子不仅导致了持久的炎症过程，同时参与了骨和软骨破坏过程以及疼痛的传输［12］。本研究结果显示，独活寄生汤组、阳性组中血清和软骨组织中的IL-4、IL-6、TNF-α 的表达明显降低，IL-10 表达升高，说明独活寄生汤抑制了炎性因子的表达，进而影响炎性细胞浸润至损伤的局部组织，这可能是独活寄生汤治疗KOA 的机制之一；NF-κB 作为炎症反应中重要的转录因子，其不仅存在于KOA 患者的软骨组织中，同时在滑膜组织、关节液及周围肌肉中均有表达，正常生理状态下，胞内NF-κB 二聚体，包括p65 被IκB 隔离在细胞质中，当NF-κB 信号通路被上游因子激活时，IκB 被磷酸化后NF-κB 蛋白被释放，从而向细胞核内迁移来促进或抑制特定因子的表达［13-14］。本研究结果显示，独活寄生汤高剂量组和阳性组软骨组织中的NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平均明显降低。国内学者陈鹏等［15］通过制备兔KOA 模型证实KOA 炎症可能与其上调滑膜组织中滑膜细胞LXRs/NF-κB通路、下调P65蛋白，进而抑制下游TNF-α、IL-1β等因子的表达有关。另有学者建立SD 大鼠膝骨关节炎模型，使用消肿止痛颗粒干预8 周后，与模型对照组比较，消肿止痛颗粒组关节软骨组织中NF-κB mRNA 表达明显降低，这些研究与本研究的结果相一致，说明独活寄生汤抑制KOA 的发展与NF-κB p65 及p-NF-κB p65 因子密切相关，是其作用机制之一。

综上所述，独活寄生汤可能通过抑制IL-4、IL-6、TNF-α、NF-κB p65 及p-NF-κB p65 表达，促进IL-10 升高来减轻关节软骨的退变，从而延缓KOA病情的进展。