黄金胶囊对2 型糖尿病大鼠肝脏组织IRE-1、CHOP 表达的影响∗

高 攀，余臣祖，康学东

1 榆林市第一医院，陕西 榆林 718000； 2 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730101；3 甘肃中医药大学附属医院,甘肃 兰州 730020

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）其并发症多且损害严重，严重增加我国居民医疗负担及生活质量。目前主流思想认为与胰岛细胞功能相关，然而它的详尽机理还没有全部阐明。据有关研究显示，肥胖是糖尿病发生的前期高危因子，肥胖可以激活机体细胞的炎症信号通路，产生氧化应激反应，然而它的深层次发病机制还未完全解释明白［1-2］。研究认为，内质网应激介入T2DM的发展演变过程，与IR 和β细胞功能减退紧密相关，参与肥胖、IR 和糖尿病的发生、发展，有很大可能是氧化应激、炎症的始动因子，在治疗糖尿病方面，是一个急待挖掘新型靶点［3-4］。目前临床上发现噻唑烷二酮在改善胰岛功能方面疗效显著，但因众多副作用，严重降低患者的依存性，同时单药使用5 年后有效率下降，需进一步联合用药，中医药的研发不失为一个很好的衔接点，黄金胶囊是甘肃中医药大学附属医院名中医崔庆荣主任医师在长期临床实践的基础上结合浊毒理论，从南宋陈无择《三因极一病证方论》温胆汤加减化裁而来，全方具有清热解毒、运脾化浊之效，前期研究显示，其能降低血糖、改善胰岛素抵抗［5-6］。本实验通过观察肝样本ERS 标志性分子肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme-1，IRE-1）、转录因子C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）的表达情况，深挖黄金胶囊治疗T2DM的潜在机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性Wistar 大鼠，平均体质量（200±20）g，2～3 月龄，共60 只。取材于甘肃中医药大学清洁级动物繁殖区，实验动物合格证号：SCXK（甘）2015-0002。饲养条件：室内温度20～25 ℃，空气相对湿度40%～70%，饲养许可证号：SYXK（甘）2015-0005。动物实验符合甘肃中医药大学动物实验伦理要求

1.2 实验药物黄金胶囊（黄连、鸡内金、法半夏、竹茹、枳实、陈皮、茯苓、炙甘草）（甘肃中医药大学附属医院制剂科提供，批号：171103，规格：0.45 g/粒）；罗格列酮（重庆涪陵制药厂，国药准字H20041399，规格：4 mg/片）；0.9%氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司，批号：N18040807-1，规格：0.9 g：250 mL/瓶）。

1.3 试剂与仪器链脲佐菌素（北京索莱宝科技有限公司，批号：641J033）；IRE-1（上海钰博生物科技有限公司，批号：YB-16696R）；CHOP（上海钰博生物科技有限公司，批号：YM3668）；高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）（南京建成生物工程研究所，批号：A112-1）；低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）（南京建成生物工程研究所，批号：A113-1）；总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）（南京建成生物工程研究所，批号：A111-1）；甘油三酯（triglyceride，TG）（南京建成生物工程研究所，批号：A110-1-1）；引物设计合成（上海生工公司）。DZF-OB 型台式电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；02211601B 型血糖仪（美国强生器材有限公司）；DW-HL528 型超低温冰箱（美国Thermo 公司）；LDZX-50KBS 型灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；DYY-6D 型Western blot 转膜仪（北京六一生物科技有限公司），iMark 型酶标仪（BIO-RAD 公司）；SK-O180-E 型摇床（德国IKA公司）；DYY-6D 型Western blot 电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；BC/BD-208HNE 型恒温培养箱（澳柯玛股份有限公司）；TGL-16 型高速低温台式离心机（德国Eppendorf 公司）；MX-S 型涡旋振荡器（美国赛洛捷克）；D1008E 型小型离心机（美国赛洛捷克）；NanoDrop One型NanoDrop核酸浓度测量仪（美国Thermo）；Applied Biosystems Step One PlusTM型实时定量PCR仪（美国Agilent）。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模 首先给予大鼠普通饲料适应环境1周，然后禁食12 h，抽取尾静脉测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。血糖位于4.77～7.77 mmol/L 范围内的样本作为研究选材［7］。将入选的56只样本鼠按体质量编号并用数字表随机分为正常组（8 只）与造模组（48 只），造模组大鼠给予高糖高脂饲料喂养，空白组给予普通饲料喂养，喂养4周，观察大鼠体质量变化，体质量增加10%为达标，其中1只大鼠体质量不达标剔除［8］。给予造模组大鼠在后空腹12 h后，每只分别单次按35 mg/kg的量腹腔注射STZ，3天后测定大鼠血糖满足FPG≥11.0 mmol/L或PPG≥16.7 mmol/L并在两周后血糖仍旧维持达标状态大鼠作为模型实验鼠。随机将血糖达到制模标准的模型鼠40只分成罗格列酮组、模型组以及黄金胶囊高、中、低组5个组。

1.4.2 给药方法 按人与大鼠体表面积折算法及前期实验研究［6］制定相应的药物剂量，黄金胶囊给药剂量：高剂量组2.025 g/kg、中剂量组1.265 g/kg、低剂量组0.675 g/kg，罗格列酮组0.5 mg/kg，空白组、模型组给予等剂量的生理盐水。各组大鼠每日灌胃1次，共治疗10周。

1.5 指标检测1.5.1 FBG及血脂四项 灌胃结束后，隔夜禁食、水12 h，采血测FBG；采血后离心机离心，用ELISA 法测试血脂四项（TC、TG、HDL-C、LDL-C）。

1.5.2 RT-PCR检测IRE-1、CHOP的mRNA表达 取肝脏组织，放置于提前编号的冻存管中，置于-80℃冰箱。采用Trizol 法从大鼠肝组织中提取RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，采用两步法PCR反应程序，Step1：95 ℃ 120 s，1Cycles，Step2：95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，40Cycles，以β-actin为内参，用2-△△ct计算mRNA的相对表达量。见表1。

表1 基因引物序列

1.5.3 肝组织病理观察 肝脏样本4%甲醛固定，石蜡包埋，制成冠状切片，苏木素-伊红液染色，观测肝样本组织镜下病理形态学变化。

1.5.4 Western blot 检测IRE-1、CHOP 的蛋白表达 取200 mg 冰冻的肝样本组织提取其内蛋白，BCA法测定含量，变性蛋白样本，通过SDS-PAGE电泳分离，进行印迹转膜，然后利用抗体免疫杂交，在暗室曝光显影，使用Quantity One 软件对条带光密度定量分析，通过各研究蛋白和对应内参条带灰度值比，评估研究蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法全部原始资料导入SPSS 20.0软件中分析，计量资料以±s表示，通过单因素（one-way ANOVA）方差分析多组间比较，继以LSD进行多重比较，对于方差不齐的数据使用Games-Howell方法分析，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠FBG水平与模型组比较，罗格列酮组及黄金胶囊组血FBG 均有所下降（P＜0.05）；与常规罗格列酮组比较，黄金胶囊中、低剂量组疗效欠佳（P＜0.05），但高剂量组与之效果接近（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠治疗后FBG及血脂指标比较（±s） mmol/L

表2 各组大鼠治疗后FBG及血脂指标比较（±s） mmol/L

注：与空白组比较，1）表示P＜0.05；与模型组比较，2）表示P＜0.05；与罗格列酮组比较，3）表示P＜0.05

组别空白组模型组罗格列酮组黄金胶囊低剂量组黄金胶囊中剂量组黄金胶囊高剂量组HDL-C 8.68±2.01 2.33±1.781）8.14±2.612）1.79±0.732）3）3.62±1.702）3）6.85±1.972）鼠数8 8 8 8 8 8 FBG 4.725±0.982 17.888±1.8711）8.113±0.7181）2）14.500±2.0451）2）3）9.763±0.9271）2）3）7.775±0.5311）2）TG 0.45±0.40 2.23±0.611）0.51±0.252）2.23±0.442）3）0.93±0.472）3）0.54±0.342）T-CHO 2.40±0.94 4.99±2.281）2.62±0.662）4.05±1.102）3）3.43±0.952）3）2.63±1.382）LDL-C 1.09±0.60 5.15±1.731）1.11±0.572）4.62±1.862）3）2.66±0.802）3）1.25±0.602）

2.2 血脂水平与模型组比较，罗格列酮组及黄金胶囊组血脂水平均有所下降（P＜0.05）；与常规罗格列酮西药组比较，黄金中药组中、低剂量组疗效欠佳（P＜0.05），但高剂量组与之功效接近（P＞0.05）。见表2。

2.3 大鼠肝脏病理形态空白组HE 切片均匀染色，可见清晰的肝叶结构，规则的肝索排列，清晰的细胞核结构，无显著的脂肪变性、坏死，界板无炎症或纤维化。模型组与空白组比较，肝小叶结构失去正常形态，肝索紊乱地排列，整体背景染色变淡，肝细胞的体积增大，脂肪沉积呈气球样变性，周围有许多炎性细胞浸润。与模型组相比，罗格列酮组整体肝小叶结构较为清晰，与正常形态接近，肝细胞排列也相对整齐，其周围偶尔可见穿插少量的炎性细胞，同时肝细胞的气球样脂肪变性也相对减少。与模型组相比，随着药物浓度的增高，黄金胶囊组样本切片镜下肝小叶结构由模糊变得清晰，肝索排列由紊乱变得规则，而肝细胞脂肪气球样变性随之减轻，其周围的炎性细胞浸润也明显减少，见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织病理形态（HE，×40）

2.4 大鼠肝脏组织lRE-1、CHOP mRNA 及蛋白表达与空白组比较，模型组肝样本中IRE-1、CHOP mRNA 转录及蛋白表达均增加（P＜0.05）；与模型组比较，罗格列酮组和黄金胶囊组IRE-1 mRNA转录及蛋白表达均降低（P＜0.05）；与模型组比较，罗格列酮及黄金胶囊高、中剂量组CHOP mRNA 转录及蛋白表达均降低（P＜0.05）；与罗格列酮组比较，黄金胶囊中、低剂量组疗效欠佳（P＜0.05），但高剂量组与之效果接近（P＞0.05）。见表3、图2。

图2 各组大鼠肝脏组织IRE-1、CHOP蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠肝脏组织lRE-1、CHOP mRNA及蛋白水平比较（±s）

表3 各组大鼠肝脏组织lRE-1、CHOP mRNA及蛋白水平比较（±s）

注：1）表示与空白组比较P＜0.01；2）表示与模型组比较P＜0.05；3）表示与罗格列酮组比较P＜0.05

组别空白组模型组罗格列酮组黄金胶囊低剂量组黄金胶囊中剂量组黄金胶囊高剂量组CHOP 1.480±0.065 2.663±0.1921）1.543±0.0212）2.202±0.0892）3）1.990±0.0832）3）1.696±0.0962）鼠数8 8 8 8 88 IRE-1 mRNA 1.002±0.085 2.803±0.1141）1.265±0.0202）2.258±0.030）2）3）1.775±0.0272）3）1.146±0.0332）CHOP mRNA 1.002±0.074 2.586±0.0191）1.368±0.0162）2.153±0.0012）3）1.730±0.0262）3）1.168±0.0182）IRE-1 0.763±0.039 1.465±0.1281）0.855±0.0572）1.261±0.0472）3）1.118±0.0382）3）0.825±0.0372）

3 讨论

内质网是人体细胞的“加工车间”，是细胞内物质运输的枢纽站，参与蛋白质与脂质的合成与转运。机体长期处于糖毒、脂毒环境中，会促使胰岛素的分泌增多，增加内质网合成折叠蛋白的负荷，产生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活PKR 样内质网激酶、肌醇蛋白1（inositol-requiring enzyme1，IRE1）和活化转录因子6 等信号通路向细胞核传递信息，细胞通过反馈减少内质网加工蛋白的来源，增加内质网中酶折叠蛋白的能力和降解蛋白的能力，从而进行自我保护，一旦上述代偿机制崩溃，则启动凋细胞亡机制［9-11］。对于ERS 反应由自我保护到启动凋亡程序的具体机制尚不清楚，可能与内质网损伤程度、IRE1α 构象变化等因素相关［12］。GHOSH等［13］使用变构抑制剂抑制IRE1α 的RNA 酶的活性，结果发现胰岛β细胞的活力与功能在内质网应激过程中得到保护。在另一个研究中，研究者给予Bi-1（Bax 抑制剂-1，是IRE1α 的负性调控因子）基因敲除小鼠ERS 诱导剂后显示IRE1α 依赖性肝细胞死亡途径增强，在该研究的子实验中发现Bi-1 基因敲除小鼠表达IRE1α、XBP1 和CHOP 增多，激活细胞死亡途径，导致非酒精性脂肪肝［14］。胰岛素抵抗常可使脂肪在肝脏沉积发生脂肪变、增加肝糖原分解输出，产生内质网应激，常在肥胖小鼠肝脏和脂肪组织病理切片中发现［15］。根据血糖结果提示模型制作成功，在大鼠血脂水平升高的同时病理HE 染色模型组大鼠肝脏细胞出现明显的脂肪沉积、气球样变性、体积增大并伴有大量的炎性细胞浸润。作为内质网应激发生的分子标志IRE-1、CHOP蛋白与mRNA表达水平也明显升高，表明内质网功能紊乱对肝细胞功能造成了一定影响进而导致肝脏病理损害。与模型组比较，黄金胶囊不同剂量组IRE-1、CHOP 蛋白及mRNA 表达量明显降低，血脂水平下降，肝脏病理损害明显改善，提示黄金胶囊可以通过降低IRE-1、CHOP 表达起到保护肝脏内质网应激的作用。

中医学认为，人体营养物质的代谢正常途径，首先由胃腐熟水谷中的精微，由脾运化传递，上达至肺，联合自然清轻之气形成宗气，在心化赤为血，配合肝的疏泄，营养四肢百骸。目前空气污染严重，人们饮食不节制，饮食不洁，精神压力增加，劳伤增加。外环境、饮食习惯不良浊毒之邪皆会损害运化水谷精微的肺脾，脾气不升则痰湿生化有源，肺气不降则浊阴归途无路。精神压力大使肝气不得疏泄，疏泄功能下降影响血液的运行导致血瘀，横逆克土，进一步阻碍脾胃的运化，使痰、湿进一步增加。劳伤使各脏腑功能失调，影响营养物质的输布。由此导致人体各脏腑功能紊乱，精微物质瘀积，形成痰饮、瘀血等病理产物，变生浊邪，久郁化热，成为浊毒。浊毒可流注于四肢关节、脏腑百骸而发挥其相应的致病作用，究其病机，多为肺、肝、脾脏腑功能失调，浊毒内蕴。从微观角度看，糖毒、脂毒等多种因素作用于细胞内质网，引发内质网应激，进而产生氧化应激、细胞凋亡造成病理损害，似乎与之相投。因此增强脏腑功能，增强内质网处理错误折叠蛋白的能力，减除浊毒刺激，减少内质网应激反应的刺激源，减轻内质网应激反应的损害因子，维持内质网保护性应激反应，减少内质网促凋亡机制的发生，可作为药物研究的切入点。

黄金胶囊用药根据糖尿病浊毒理论机制，方中黄连味苦性寒，清烦躁郁热之火，燥脾、胃、胆、大肠之湿，清解郁毒、滋阴止渴；鸡内金其性平和，通达脾、胃、小肠、膀胱经，可健补脾胃，消除脏腑之瘀积，有缩小便之功。二者共为君药，使脾胃泻中有补，使痰浊燥消并用，釜底抽薪，使浊去毒无所依，标本兼治，化浊解毒，具有治疗脾瘅、消渴的作用。法半夏味苦性燥，降脾胃之浊气，祛湿浊之壅滞；竹茹秉微凉之体，清肺胃之郁热，降肺、胃、胆气于下，引湿浊下行；枳实破气下行，涤湿浊之凝滞；陈皮辛散导滞，苦燥消痰，畅达脾土之气；茯苓甘补健脾以升清。以上五药为臣药，使脾胃后天之气升降相宜，湿浊无藏匿之所。炙甘草味甘气温，顺达诸性，配润剂含育阴之功，协和诸药，使之不争，为使药。本方补泻并用，寒热同调，共奏运脾化浊，清解郁毒之功。

综上所述，链脲佐菌素诱导的2 型糖尿病模型大鼠肝脏组织中存在IRE-1、CHOP 基因表达的异常，黄金胶囊通过降低IRE-1、CHOP 表达而改善内质网应激，从而发挥其治疗2型糖尿病的作用。