基于网络药理学与分子对接技术探讨麻子仁丸治疗功能性便秘的作用机制∗

张 洋，陈 萌，张虹玺

辽宁中医药大学附属第三医院,辽宁 沈阳 110042

功能性便秘（functional constipation，FC）是指排除肠管器质性病变、全身系统性疾病及药物等继发性因素所致的慢性便秘［1］。随着现代人们生活节奏的不断加快、饮食习惯的改变，运动量的下降，其发病率逐年增加，并成为最常见的胃肠道疾病之一［2］，它会对个人的生活质量产生重大影响，并造成沉重的经济负担［3］。便秘的发病机制较为复杂，目前尚未明确，可能与情绪、饮食、遗传等多方面因素有关［4-6］。现代医学针对FC 的治疗手段较为单一，主要通过补充膳食纤维、应用渗透性泻药和5-羟色胺受体激动剂来治疗，但疗效并不理想［7］。越来越多的患者开始寻求中医药治疗并取得良好的疗效。麻子仁丸出自《伤寒论》，又名脾约丸，用来治疗“小便频数，大便硬”等症状［8-9］，其具有清热润肠、益气通便的作用［10］。组方在小承气汤基础上加火麻仁、杏仁、芍药并减少药物用量，虽然临床效果显著但是作用机制不明确，因此本研究旨在结合网络药理学和分子对接技术探讨麻子仁丸治疗功能性便秘的作用机制。

1 资料与方法

1.1 基因收集及筛选

1.1.1 麻子仁丸活性成分及靶点收集 分别以“火麻仁”“大黄”“枳实”“厚朴”“苦杏仁”“白芍”为关键词，在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）数据库中检索麻子仁丸中所有组方成分的活性成分。再设定“生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，半衰期（half-life，HL）≥4”为筛选条件筛选出符合要求的有效活性成分并获得相应的靶点。通过Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库获得蛋白名称。

1.1.2 FC 相关基因收集及潜在靶点预测 在GeneCards（htths：//www.genecards.org 数据库中以“functional constipation”为关键词检索“功能性便秘”的相关基因。使用R 3.6.3 程序取麻子仁丸有效活性成分作用靶点和FC 相关基因的交集靶点，并获得韦恩图。

1.2 有效活性成分-靶点网络构建将获取的交集靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件中构建有效活性成分-靶点网络，计算Degree值，筛选出Degree值较高的有效活性成分用于分子对接。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建将获取的交集基因导入STRING 数据库中生成PPI 网络（https：//string-db.org/）来明确潜在靶点间的相互作用，再通过Cytoscape 3.7.2 软件进行PPI网络可视化调节。计算各节点平均Degree 值获取核心靶点。

1.4 GO富集分析和KEGG富集分析基于Bioconductor数据库（http：//www.bioconductor.org/）通过R3.6.3 对潜在靶点进行GO 和KEGG 富集分析，并取富集程度最高的前20 名进行可视化构建，通过了解生物过程及信号通路过程分析麻子仁丸治疗功能型便秘可能的作用机制。

1.5 分子对接通过RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获取Degree值排名前5的核心靶点的3D结构，再由TCMSP数据库及文献中查找并下载麻子仁丸Degree值排名前5的有效活性成分、枸橼酸莫沙必利和乳果糖的3D结构。将获取的核心靶点3D结构导入PyMOL 1.7.2.1软件进行清除配体、去水、加氢等操作，应用AutoDockTools 1.5.6软件将蛋白和化合物转换为pdbqt格式文件，最后利用Autodock Vina 1.1.2软件进行分子对接。

2 结果

2.1 活性成分筛选及靶点预测在TCMPS 数据库中检索麻子仁丸中的药物6味，共获得541种活性成分。本研究选择OB≥30%，DL≥0.18，HL≥4作为筛选条件。其中OB 可以反映药物被吸收进入人体循环的药量比例，DL 为类药性指化合物与已知药物的相似性，HL 为半衰期体现了活性成分的作用时间。经过上述筛选最终收集到57 个有效活性成分（枳实和火麻仁共有成分1 个，苦杏仁和白芍共有成分一个，大黄和白芍共有成分1 个，火麻仁、苦杏仁和白芍共有成分1 个，火麻仁和苦杏仁共有成分2 个）。其中较重要的有效成分有lu‐teolin、kaempferol、arachidonic acid 等。进一步在TCMPS 数据库中检索麻子仁丸中的6 味药物的作用靶点共获得5001 个，使用UniProt 数据库将靶基因蛋白名称转换为基因名称，筛选、去重后得到有效活性成分作用靶点167 个。在Gene Cards 数据库中以“functional constipation”为关键词检索功能型便秘的相关靶点，共获得4948个FC相关靶点基因。

2.2 构建蛋白质互作网络图并提取核心蛋白基于STRING 数据库，将筛选出的135 个交集基因使用Cytoscape 3.7.2 软件构建成蛋白质互作可视化网络图，共135 个节点和2033 条边，平均度值30.1。每个靶点间连线代表靶点间的相互作用，Degree 值代表该靶点在网络中的重要性，Degree值越高连线数越多。根据Degree 值排序筛选出30 个核心靶点蛋白，其中前5 名的靶点为AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3。见图1。

图1 核心靶点蛋白

2.3 构建有效活性成分-靶点网络图将筛选出的活性成分有效作用靶点与FC 靶点取交集处理，筛选出共同的靶点，得到135 个交集基因，制作韦恩（Venn）图。运用Cytoscape 3.7.2 软件进行有效活性成分-靶点可视化网络图的构建。见图2。

2.4 分子对接应用 AutoDock Vina 1.1.2软件对木犀草素Luteolin、山柰酚Kaempferol、花生四烯酸Arachidonic Acid、柚皮素Naringenin、川陈皮素Nobiletin和AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3进行分子对接分析。一般认为结合能≤-5.0 KJ/MOL 表示有效成分与靶点间结合能力较强，发生作用的可能性大［10］。对接结果表明麻子仁丸中的中药活性成分普遍与FC 的关键靶点具有较好的结合力，其中犀草素、山柰酚、川陈皮素与AKT1、IL-6 结合力最好，阳性对照组枸橼酸莫沙必利、乳果糖与相应靶点结合力相近。见图3，表1。

图3 分子对接分析图

2.5 有效靶点GO分析及KEGG通路富集分析在Bioconductor 数据库基础上通过R 语言3.6.3 设定“P=0.05，Q=0.05”将135 个有效交集潜在靶点进行GO 和KEGG 富集分析，并提取显著性前20 条目制作条形图。GO 分析结果共获取条目154 个，其中显示富集最多的为10个，麻子仁丸治疗FC可能与直接配体调节序列特异性DNA 结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、酰胺结合、类固醇结合、肽结合、受体下游信号转导等生物过程有关。KEGG分析共获得175 条信号传导通路，其中有16 条富集显著性较高的结果，包括：AGE-RAGE、TNF、IL-17、PI3K-AKT 等信号通路，除以上信号通路外还可能和乙型肝炎、前列腺癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、流体剪切应力与动脉粥样硬化、丙型肝炎、弓形虫病、铂类耐药、人巨细胞病毒感染、膀胱癌、胰腺癌、内分泌抵抗、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药等疾病有关。见图4—5。

图4 GO富集分析结果

3 讨论

FC 的发病机制涉及多系统、多学科，通常病情反复不易治愈［11］。现代医学一般建议患者在改善饮食和生活习惯的同时配合促胃肠动力药物、缓泻剂等药物进行治疗［12-13］。临床常用的枸橼酸莫沙必利是一种5-羟色胺受体激动剂，可以改善胃肠道动力从而促进排便［14］，而乳果糖作为一种渗泻剂可以吸收水分，刺激肠道蠕动加快排便，美国FDA 批准乳果糖用于治疗便秘［15］。上述药物虽被证实治疗FC 有效，但无法从根本上解决问题，还可能产生不良反应。中医药在FC 的治疗中起到重要的作用，麻子仁丸作为治疗便秘的经方沿用至今，临床效果显著。但由于FC 发病机制不明确且中医药治疗功能型便秘的作用机制无法阐明，因此对于使用中药治疗FC具有诸多不确定性。

本研究通过网络药理学的方法提取出麻子仁丸主要有效成分木犀草素、山柰酚、花生四烯酸、柚皮素、川陈皮素等。通过与FC 靶点取交集的方法预测出关键靶点，包括AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3等。FC 由于排便困难粪便长期留存于肠道中，可能刺激肠黏膜发生炎症反应，同时肠道内毒素无法排出也易发生肠道感染，干结的粪便还可能损伤肠道造成感染［16］。因此FC 患者均出现不同程度包括IL-6 在内的炎性因子的升高［17］。FC除引起炎症反应外，还是结直肠恶性肿瘤的重要发 病 原 因 之 一［18］，CASP 与 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 有关［19］。研 究 表 明，AKT、MAPK 等 也 与FC 发 病 有关［20-21］。木犀草素、山柰酚、花生四烯酸、川陈皮素均具有消炎、抗菌等作用［22-24］。柚皮素可以通过调节结肠平滑肌细胞收缩产生通便作用［25］。麻子仁丸中的有效成分可能通过抗炎、预防肿瘤、调节肠道平滑肌细胞等作用调控AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3 等达到治疗FC 的目的。将重要的有效成分与预测的关键靶点进行分子对接处理发现，有效成分与关键靶点均有较强的结合力，且与阳性对照枸橼酸莫沙必利、乳果糖相近。说明木犀草素、山柰酚、川陈皮素等与FC 关键靶点结合力较好，可能对于治疗FC 起到重要作用。KEGG 富集分析结果显示麻子仁丸可能通过AGERAGE 信号通路激活PI3K-Akt 通路影响AKT1 等靶点［26］，还可能作用于IL-17 信号通路调控IL-6、MAPK1 等，AKT1、IL-6、MAPK1 等靶点可能通过TNF信号进行通路调节［27］。

本研究基于网络药理学和分子对接技术对麻子仁丸的有效活性成分和作用靶点进行筛选。得出结果：麻子仁丸的主要有效成分木犀草素、山柰酚、花生四烯酸、柚皮素、川陈皮素等，可能通过AGE-RAGE、TNF、IL-17、PI3K-Akt 等信号通路调节直接配体调节序列特异性DNA 结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合等生物过程调控AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3 等核心蛋白，发挥抑制炎性反应、防止病情恶化、治疗FC的作用。