利用CRISPR/Cas9技术构建MDH2敲除细胞株及抗呕吐毒素效应研究

施炜涛 姚春鹏 魏文康 王蕾 房元杰 仝钰洁 马晓姣 蒋文张晓爱 邵伟

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.广东省农业科学院农业生物基因研究中心 广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，广州 510640；3.广东省农业科学院蔬菜研究所 广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州 510640）

呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），属于B型单端孢霉烯族毒素，作为一种广泛存在于谷物和动物饲料以及食品中的真菌毒素，可由禾谷镰刀菌、亚洲镰刀菌等多种镰刀菌产生［1-2］。受到霉菌污染的玉米、小麦、大豆等饲料原料及青贮饲料中均存在不同浓度的DON［3-4］。在对陕西、新疆、甘肃和宁夏4省收获的小麦进行DON含量及流行率检测，结果显示82.9%的样品受到DON污染，平均浓度达500 μg/kg，根据我国规定的DON标准（中国国家标准GB2761-2017），其中10%的阳性样品超过1 000 μg/kg的最大限值［1］。对多地的饲料及原料取样监测分析，其中玉米及其副产品均有不同程度的DON污染［5］。一份对猪饲料样品的霉菌毒素含量检测报告显示，DON在不同品种猪饲料中含量普遍偏高，其中空怀母猪料和育肥料中DON含量高于国家规定［6］。

DON属于剧毒或中等毒物的范畴，对人和动物具有广泛的毒性效应，具体表现为呕吐、炎症、消化道出血，甚至死亡［7-8］。猪是对DON最敏感的动物之一，其次为小鼠、大鼠、家禽和反刍动物［9］。DON不仅对猪肠道具有局部毒性，而且会导致许多肠道功能失调并削弱免疫反应，减少采食量和体重增加［10］。摄入含DON的饲料时，猪的肠道会出现绒毛顶端坏死、多灶性萎缩和绒毛融合、固有层水肿、肠细胞胞浆空泡化、十二指肠绒毛高度降低和肠道细胞溶解等情况［11］。而当饲料中同时存在呕吐毒素和其他霉菌毒素如镰刀菌酸时，相互之间会产生协同和相加效应，混合物整体的毒性增强，出现呕吐、拒食、生长缓慢等现象［12-16］。

近年来已报道多个与DON毒性有关的基因，王海飞等［16］利用CRISPR/Cas9敲除文库筛选到THEM5等DON抗性重要候选基因。许写等［17］通过构建了稳定干扰METTL3基因表达水平的IPEC-J2细胞系，发现降低该基因的表达水平可以抵抗由DON诱发的细胞凋亡和炎症。Xu等［18］研究报道SLC4A11和MFSD3基因的过表达能够增强DON处理下IPEC-J2细胞的活力。

苹果酸脱氢酶2（MDH2）是线粒体中三羧酸循环（TCA）的关键酶之一，利用催化H+从苹果酸的羟基转移至NAD+上，以实现苹果酸和草酰乙酸之间的可逆转化，在乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖的发生和氧化/还原平衡等代谢途径也发挥重要作用。MDH2以二聚体形式存在，单体分子量35.6 kD左右，包含5个NAD+结合位点和1个质子结合位点［19］。已有研究报道MDH2与癌症有密切联系，MDH2能够通过抑制PTEN增强子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭［20］。刺激MDH2能够激活AKT通路，从而导致非小细胞肺癌（NSCLC）的转移和侵袭［21］。在前列腺癌细胞中也检测到MDH2的表达升高［22］。此外，MDH2被确定为是嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的易感基因［23］。但目前尚未报道MDH2和毒素之间的存在联系。

前期我们利用CRISPR文库筛选了呕吐毒素诱导细胞死亡的相关基因发现，MDH2是候选基因之一。但目前对于MDH2基因对于DON的影响在国内外期刊中并没有相关报道，因此本研究采用CRISPR/Cas9系统构建猪MDH2基因稳定敲除的IPEC-J2细胞株，并检测了MDH2基因抗DON毒性效应的影响，为后续深入探究MDH2基因对DON的毒性作用机制奠定基础。MDH2基因后续可以作为抗DON的靶标，基因敲除或针对该靶标开发相关药物，可降低DON对肠道细胞的损伤以及对人和动物的毒性，在医疗和畜牧业中具有潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

IPEC-J2细胞系由本研究室保存；呕吐毒素和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；pSpCas9-2A-Puro（PX459）V2.0质粒购自淼灵生物科技有限公司；P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit转染试剂盒购自Lonza公司；T4连接酶、T4 PNK、10×T4连接缓冲液、限制性核酸内切酶BbsI购自New England Biolabs公司；大肠杆菌E.coliDH 5α感受态细胞购自北京金沙生物科技有限公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生物公司；胎牛血清FBS、胰酶、DMEM/F12培养基、嘌呤霉素购自Gibco公司；青霉素-链霉素双抗购自Hyclone公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自Procell公司；通用型RNA提取试剂盒购自艾科瑞生物技术有限公司；一抗Anti-MDH2购自HUABIO公司；Anti-Tubulin购自Cell Signaling Technology公司；二抗Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP和Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP购自Affinity 公司；动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒购自索莱宝公司；CCK8（cell counting kit-8）试剂盒购自Apexbio公司；YO-PRO-1/PI细胞凋亡与坏死检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 DMEM/F12完全培养基包含10%FBS和1%双抗，IPEC-J2细胞接种于25 cm2底面积培养瓶中，放在37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。

1.2.2 DON的配制 用DMSO将DON粉末溶解，用0.22 μm滤膜过滤，配成5 mg/mL母液。再分别用DMEM/F12完全培养基配成浓度分别为4、2、1和0.5 μg/mL的DON溶液，整个过程在生物安全柜中完成。

1.2.3 猪MDH2基因sgRNA的设计 针对猪源MDH2基因（NCBI Gene ID: 397039）使用CRISPR DESIGN（http://crispr.mit.edu）网站进行设计，根据评分选取位于外显子9126-9203区域的sgRNA。并在sgRNA的5'端添加CACCG，形成正向Oligo DNA（sgRNA-MDH2-F），在反向Oligo DNA（sgRNAMDH2-R）的3'端添加C，在5'端添加AAAC（表1）。

表1 MDH2靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列Table 1 MDH2 targeting sites and sgRNA oligonucleotide sequences

1.2.4 猪MDH2基因编辑载体的构建及阳性克隆的筛选 首先将以上正链Oligo DNA（sgRNAMDH2-F）和负链Oligo DNA（sgRNA-MDH2-R）退火形成dsDNA，反应体系：正负链Oligo DNA各1 μL，10×T4 连接缓冲液1 μL，T4 PNK 0.5 μL，补H2O至10 μL，离心后置于PCR反应仪中进行反应（37℃ 30 min；95℃ 5 min）。取退火后形成的dsDNA与PX459载体连接，酶切与连接反应体系：PX459质粒模板25 ng，dsDNA和10×T4连接缓冲液各1 μL，BbsI和T4连接酶各0.5 μL，加入ddH2O补至10 μL体系，各成分离心后置于PCR反应仪中进行反应（37℃ 5 min；23℃ 5 min，25循环）。

放置连接产物和感受态细胞混合物于冰上30 min后42℃水浴热击90 s，经过冰浴冷却5 min后，加入普通的LB液体培养基，置于37℃振荡培养1 h，使细菌表达质粒编码的Amp抗性基因并恢复到正常生长状态；将菌液均匀涂布于含Amp的LB固体培养平板上，将培养皿倒置于37℃培养箱过夜培养。用含Amp的LB液体培养基对挑取的若干单菌落扩大培养，并提取质粒送至生工使用U6启动子进行测序。

1.2.5 基因编辑载体的转染及嘌呤霉素的筛选 用DMEM/F12完全培养基培养IPEC-J2细胞，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，待细胞密度达到70%-80%时，用胰酶将细胞消化下来，使用Lonza电转仪将上述构建的基因编辑载体导入细胞核中。用浓度为4 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基连续筛选7 d，每2 d更换新鲜的含嘌呤霉素完全培养基，同时以IPEC-J2细胞作为对照组进行观察。待对照组完全死亡后用胰酶将存活的混合克隆细胞群消化下来，使用有限稀释法稀释成单克隆细胞于96孔板中。

1.2.6 单克隆细胞的筛选 待96孔板中的单克隆细胞团生长至一定数量，转移至24孔板中进一步扩大培养，再进一步扩大至6孔板中，提取细胞的基因组DNA，设计特异性引物并进行高保真PCR，将PCR产物送至生工进行测序。引物序列请见表2。

表2 MDH2基因PCR测序引物Table 2 Primers for PCR sequencing of MDH2 gene

1.2.7 RT-qPCR检测细胞中MDH2基因的表达水平 提取野生型IPEC-J2细胞和MDH2-KO细胞的RNA，通过逆转录为cDNA，加入到荧光定量PCR 96孔板之中，使用设计的引物进行扩增，94℃预变性30 s；94℃变性5 s、57℃退火15 s、72℃延伸10 s并收集荧光信号，共40个循环。每个样品设计5复孔，并以β-actin作为参照基因，用相对定量法对结果进行分析。引物序列请见表3。

表3 MDH2基因RT-qPCR引物Table 3 RT-qPCR primers for MDH2 gene

1.2.8 Western Blot检测细胞中MDH2蛋白的表达水平 将野生型IPEC-J2细胞和MDH2-KO细胞分别培养于六孔板中，等待长满全孔后弃去培养基，用PBS清洗两遍后使用细胞裂解液裂解细胞，冰上孵育10 min后离心取上清，加入上样buffer，100℃煮样10 min获得蛋白样品。对照组和试验组分别各取15 μg蛋白样品通过10%的电泳胶进行分离，并转移至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉溶液室温封闭后，TBST洗去剩余奶粉，一抗Anti-MDH2（1∶1 000稀释）于4℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次20 min。用1∶6 000稀释的二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP与膜在室温下孵育1 h，TBST洗膜4次，每次20 min。显影液漂洗后用化学发光仪显色拍照，以Tubulin为内参蛋白。

1.2.9 MDH2-KO在DON处理后的细胞活力测定 将野生型IPEC-J2细胞和MDH2-KO细胞以每孔2×104的密度接种96孔培养板，待细胞生长到合适密度，每孔加入不同DON浓度的完全培养基。每组加入等量100 μL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON浓度的完全培养基，每组浓度复5孔，充分混匀板中各孔的液体。第3天更换一次含不同浓度DON的完全培养基，并每天观察细胞状态，在37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养5 d。

用CCK8试剂测定细胞活力，在96孔板中选取5个无细胞孔，每孔加入100 μL DMEM/F12完全培养基，以获得背景发光值。向96孔板中有液体的每个孔中加入10 μL CCK8试剂溶液，将96孔板置于37℃细胞培养箱中孵育1 h，酶标仪测量在450 nm处的OD值。

细胞活力计算公式:

细胞活力（%）=（实验组OD-背景值OD）/（对照组OD-背景值OD）×100%

1.2.10 MDH2-KO在DON处理后细胞死亡率检测 野生型IPEC-J2细胞和MDH2-KO细胞接种于六孔板培养板中，置于37℃、5%的CO2细胞培养箱内培养。待细胞长到合适密度，每孔更换为等量2 mL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON的完全培养基，第3天更换一次含不同DON浓度的完全培养基，共处理5 d。

将对照组和试验组贴壁细胞用15%胰酶消化后用完全培养液重悬，并用PBS洗涤一次。对于上一步骤的每个沉淀加入500 μL YP1/PI检测工作液，并重悬为单细胞悬液。放入37℃培养箱中避光孵育20 min。准备仅含缓冲液的细胞样品用作流式细胞仪检测时的阴性对照，该缓冲液与配制YP1/PI检测工作液的缓冲液宜保持一致。同时准备YP1和PI的单染样品用于调节补偿。孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测（YP1染色阳性细胞为绿色荧光，Ex/Em=491/509 nm；PI染色阳性细胞为红色荧光，Ex/Em=535/617 nm），整个过程均需避光操作。将染色后的样品置于冰上，并在1 h内进行流式细胞仪检测和分析。

2 结果

2.1 MDH2基因编辑载体的构建

合成的sgRNA单链经退火形成双链，将其与PX459空载体经限制性内切酶BsbI酶切后的线性载体片段连接，构建重组质粒。从载体U6启动子后开始测序，结果显示插入PX459载体的碱基序列与设计的sgRNA序列完全一致，表明重组质粒构建成功，测序结果如图1所示，命名为PX459-sgRNA-MDH2。

图1 重组质粒PX459-sgRNA-MDH2测序峰图Fig.1 Sequencing peak of recombinant plasmid PX459-sgRNA-MDH2

2.2 MDH2-KO细胞株的构建与验证

通过单克隆稀释和扩大培养，并挑选10株单克隆细胞提取基因组DNA，将通过高保真PCR所得产物送至公司测序。测序结果显示其中一株为单峰（图2），且与野生型MDH2基因（图3）相比缺失5 bp碱基（图4），这种缺失突变可导致基因开放阅读框改变、翻译提前终止。与IPEC-J2野生型细胞株相比，该细胞株的mRNA表达水平显著降低，且组内mRNA表达水平差异有统计学意义（P＜0.001）。单克隆细胞蛋白样品的Western blot鉴定结果见图5-B，与野生型IPEC-J2细胞相比，筛选得到的细胞株中MDH2蛋白表达水平几乎完全丧失。结合基因组PCR产物测序及Western blot实验结果，认为该单克隆细胞系中目的基因被完全敲除且为单克隆，命名MDH2-KO。

图2 MDH2-KO细胞系CRISPR靶位点测序峰图Fig.2 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2-KO cell line

图3 MDH2野生型IPEC-J2细胞系CRISPR靶位点测序峰图Fig.3 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2 wild-type IPEC-J2 cell line

图4 野生型IPEC-J2细胞与MDH2-KO序列比对图Fig.4 Sequence comparison of wild-type IPEC-J2 cells with MDH2-KO

2.3 MDH2基因的敲除对IPEC-J2抗呕吐毒素毒性效应的影响

2.3.1 CCK8检测发现MDH2基因的敲除提高DON处理后的细胞活力 将野生型IPEC-J2细胞和MDH2-KO细胞系分别以每孔2×104的密度接种于96孔培养板中，用呕吐毒素（4、2、1和0.5 μg/mL）处理5 d后，用CCK8试剂测定细胞活力。发现MDH2-KO细胞系与野生型IPEC-J2细胞相比，在DON浓度为4、2、1和0.5 μg/mL的条件下细胞活力分别极显著提高18.67%（***P＜ 0.001）、19.59%（***P＜ 0.001）、26.36%（***P＜ 0.001）和27.01%（***P＜ 0.001）（图6）。表明敲除MDH2基因后可增强IPEC-J2细胞对呕吐毒素的耐受性。

2.3.2 流式检测发现MDH2基因的敲除降低DON处理后的细胞死亡率 不同浓度DON对IPEC-J2细胞和MDH2-KO细胞的死亡率影响结果如图7所示，经过YP1/PI染色和流式细胞仪检测，正常活细胞为Q4区域（YP1-/PI-），凋亡细胞的细胞核被染为绿色位于Q3区域（YP1+/PI-），坏死细胞的细胞核被染为红色位于Q1和Q2区域（YP1-/PI+和YP1+/PI+）。与野生型细胞相比，敲除MDH2使不同浓度DON（4、2、1和0.5 μg/mL）作用5 d条件下细胞死亡率分别极显著降低30.33%（***P＜ 0.001）、15.81%（***P＜ 0.001）、16.00%（***P＜ 0.001）和14.7%（***P＜ 0.001）。表明敲除MDH2基因后可增强IPEC-J2细胞对呕吐毒素的抗性。

图7 流式检测DON处理后IPEC-J2和MDH2-KO的细胞死亡率Fig.7 Flow assay of cell mortality of IPEC-J2 and MDH2-KO after DON treatment

3 讨论

本研究表明MDH2在DON诱导的细胞死亡毒性中发挥重要作用。DON毒性机制包括：诱导细胞活性氧（ROS）和活性氮（RNS）积累引起氧化应激及脂质过氧化，破坏DNA结构［24］；促进凋亡蛋白Caspase家族表达引起细胞凋亡［25］；与rRNA结合后激活p38、JNK、ERK1/2、MAPKS等信号通路抑制蛋白质合成影响细胞功能［26］。许多研究发现DON处理后细胞的ROS水平提高，与细胞凋亡和炎症相关的基因及蛋白表达增加［27-28］。而由DON处理提高的ROS会破坏线粒体膜结构，导致通透性增加，凋亡因子Cyt-c释放进入细胞质内，并激活下游Caspase凋亡蛋白家族，引发细胞凋亡［29］。此外，DON对前列腺癌细胞的作用与NF-κB/HIF-1α信号转导有关，并以剂量依赖的方式显著增加HIF-1α的表达［30］。

MDH2既在能量代谢过程中发挥关键作用，也与细胞死亡调控有密切联系。MDH2作为TCA循环的关键酶利用NAD-NADH辅酶系统催化苹果酸可逆地氧化为草酰乙酸，产生的NADH作为氧化磷酸化的还原当量，是细胞ATP生物合成、耗氧的基本过程，但同时也能为mETC提供电子诱导ROS的产生并启动细胞死亡过程［31-35］。Zhao等［36］发现敲除MDH2基因能够显著降低苹果酸处理后HeLa细胞中的ROS水平和细胞凋亡，表明MDH2在调节细胞凋亡过程中起着至关重要的作用。Wang等［37］报道了MDH2基因的突变会阻止Caspase-3活化和果蝇幼虫唾液腺细胞死亡，并导致细胞的ATP水平降低。抑制MDH2可降低肾小管上皮细胞缺氧-复氧状态下HIF-1α水平和氧化应激，并减少细胞凋亡和铁性细胞死亡，表明MDH2也可以通过调控HIF-1α相关的信号途径来调控细胞死亡［38］。

综上可见，DON与MDH2在调控细胞死亡方面存在共同的信号途径，本研究揭示了MDH2基因的敲除赋予IPEC-J2细胞抗呕吐毒素的能力，能减少呕吐毒素诱导的细胞死亡。我们推测MDH2基因的敲除可能通过降低ROS的水平、抑制Caspase凋亡蛋白和下调HIF-1α的表达，从而减少细胞死亡降低呕吐毒素对细胞的毒性。而MDH2基因在这些途径中具体发挥哪些功能还需进一步深入研究。

4 结论

本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功制备出猪MDH2基因敲除的IPEC-J2单克隆细胞系，并通过细胞活力和细胞死亡检测，证明敲除MDH2基因能使细胞具有抗呕吐毒素毒性效应的能力。