DNA甲基化在解析毛竹自然变异中的应用

李英 岳祥华

（1.国际竹藤中心竹藤资源基因科学与基因产业化研究所，北京 100102；2.国家林业和草原局 北京市竹藤科学与技术重点开放实验室，北京 100102； 3.国际竹藤中心三亚研究基地，三亚 572000）

我国是全球竹资源最丰富的国家，竹子种类、竹林面积和蓄积量均居世界之首。毛竹（Phyllostachys edulis）是我国竹类资源中栽培面积最大的竹种，毛竹林则是我国竹林的主要组成部分［1］。根据第九次全国森林资源清查数据显示，我国毛竹林面积467.78万hm2，占竹林总面积的72.96%［2］。但是，竹类植物优异种质资源挖掘严重不足，基础研究薄弱，严重影响了竹类植物资源的创新应用［3］。

毛竹是禾本科乔灌木，长期处于野生状态。由于开花周期长且大部分竹种花后很快干枯死亡，毛竹主要通过带芽的地下茎（也称“竹鞭”）、竹秆和竹枝等进行无性繁殖［4］。但是，在长期的演化过程中毛竹产生了丰富的自然变异体即突变体，它们大多由当地居民在野生的毛竹林中偶然地发现［5］。很显然，这些突变体由于体细胞突变所引起；而植物的分化发育是功能基因、调控因子和表观修饰等共同作用的结果。系统阐释毛竹自然突变体形成的调控机制不仅是竹类植物生长发育的基础理论问题，而且对竹子材性改良及竹林生长量提高均具有重要意义。本文综述了毛竹自然变异研究现状、植物DNA甲基化及其转录调控机制在植物发育过程中的研究进展，并展望了DNA甲基化在解析毛竹自然变异现象的潜在应用。因此，充分利用毛竹丰富的自然突变体材料，运用多领域技术方法联合分析策略，解析关键突变表型或性状的形成机制，有利于指导竹子精准育种。

1 毛竹自然变异研究进展

目前，中国竹类植物图鉴中记载了共17种毛竹自然突变体［6］，它们在竹秆形态、颜色和节间形态等多个方面与野生型毛竹有明显差别，分别是蝶毛竹（P.edulisf.abbreviate）、绿槽毛竹（P.edulisf.bicolor）、麻衣竹（P.edulisf.exaurita）、金丝毛竹（P.edulisf.gracilis）、黄皮毛竹（P.edulisf.holochrysa）、黄皮花毛竹（P.edulisf.huamozhu）、黄槽毛竹（P.edulisf.luteosulcata）、绿皮花毛竹（P.edulisf.nabeshimana）、强竹（P.edulisf.obliquinoda）、梅花竹（P.edulisf.obtusangula）、厚壁毛竹（P.edulisf.pachyloen）、斑毛竹（P.edulisf.porphyrosticta）圣音竹（P.edulisf.tubaeformis）、佛肚毛竹（P.edulisf.ventricosa）、龟甲竹（P.edulisf.Kikko-chiku）、花龟竹（P.edulisf.Mira）和青龙竹（P.edulisf.curviculmis）。其中，绿槽毛竹、绿皮花毛竹、斑毛竹、黄槽毛竹、黄皮花毛竹和黄皮毛竹主要在竿的颜色方面与野生型毛竹存在明显区别，而蝶毛竹、强竹、梅花竹、圣音竹、佛肚毛竹、龟甲竹、花龟竹、青龙竹和麻衣竹主要在竿的形态方面与野生型毛竹存在明显区别，至于厚皮毛竹和金丝毛竹主要在竿壁厚度方面与野生型毛竹存在明显区别。

多位学者就毛竹及其变种的生态学特性［7］、生理生化特性［8］以及出笋规律和鞭根结构［9-10］等进行了研究。据此可以发现，与野生型毛竹相比，自然突变体在组织形态、激素水平以及生态效应等方面存在明显差异。此外，多名学者运用EST、AFLP和SSR等分子标记技术，开展了野生型毛竹及其变竹的遗传变异研究［11-12］。近年来，高通量测序技术快速发展。南京林业大学竹类研究所在毛竹和多个自然突变体植株发育早期的笋芽中鉴定到与维管分生组织发育相关的基因，并且它们主要富集在细胞壁构型、植物激素信号转导等相关过程［13］。作者团队前期选取野生型毛竹及其壁厚变种厚竹（P.edulisf.pachyloen）不同发育时期的地下笋芽为材料，联合运用多组学测序技术绘制了毛竹及其变型厚竹的5个不同发育时期笋芽内部基因和miRNA动态表达图谱，基因共表达趋势分析结果显示大部分基因在发育前期存在明显的折点，并且该折点在厚竹和毛竹样本中方向相反；有趣的是，野生型毛竹及其突变体表型出现明显差异也是在这个时期。此外，该研究挖掘了调控笋芽发育的miRNA-mRNA模块，发现了植物激素细胞分裂素在促进笋芽发育中的关键作用，利用双荧光素酶报告基因技术和RNA FISH等技术验证了miRNA与靶基因间的靶向调控关系及其在笋芽分生组织中的作用位点［14］。该成果发掘了调控竹子笋芽发育的关键遗传因子，初步阐释了笋芽组织形态动态变化的分子机理，剖析了毛竹与厚竹表型明显差异的分子基础。但是，秆壁增厚这一突变表型发生的原因尚不清楚。目前，毛竹自然变异相关研究局限在资源评价、转录组分析，表观修饰对转录调控的效应及其作用机制仍不清楚。

2 DNA甲基化与转录调控的相关性

DNA甲基化（methylation）是真核细胞普遍的一种重要的调节基因转录表达表观遗传修饰方式。DAN 甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA methylthransferases，DNMTs）的作用下，以S-腺苷加硫氨酸（SAM）为供体，将甲基添加到特定碱基的过程［15］；该过程主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸CpG中胞嘧啶第五位碳原子上，其产物称为5-甲基胞嘧啶（5-mC）［16］。5-mC是真核生物DNA甲基化的主要形式，此外还存在N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）和7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。无论在植物还是动物中，CpG部分散在分布于基因组DNA序列中，部分则以高度聚集的CpG岛状态存在于转录调控区，如启动子区。在植物中，DNA甲基化往往发生在对称序列CG、CHG和非对称序列CHH（H=A、C或T）中［17］。与基因突变不同，DNA甲基化是一种可逆的化学修饰，目前发现的植物甲基化主要有从头甲基化（de novomethylation）、维持甲基化（maintenance methylation）和去甲基化（demethylation）3种模式。

以往研究结果显示DNA甲基化异常往往能够改变DNA构象、染色质结构和DNA的稳定性，进而抑制相关基因的转录调控，导致多种生物学通路的路径发生改变［18］。研究发现小麦基因启动子区域的DNA甲基化能够调控对基因的表达［19］。在某些情况下，启动子区DNA甲基化非但不抑制基因转录，相反会促进基因转录，如拟南芥的ROS1基因［20-22］和一些抑制番茄果实成熟的基因［23-24］。最近，北京林业大学油松研究团队发现油松（Pinus tabuliformis）基因组存在大量高表达的大内含子基因，DNA甲基化修饰在外显子和内含子区表现出很高的不均衡分布，作者预测DNA甲基化对基因不同区域的差异化转录调控发挥了关键作用［25］。中国科学院分子植物科学卓越创新中心朱健康研究团队发现DNA甲基化能够以多种方式调控基因的表达，并表示DNA甲基化在植物的转录调控过程扮演重要角色［26］。此外，研究发现DNA甲基化与组蛋白甲基化间存在协同作用［27-28］，DNA甲基化与组蛋白修饰及非组蛋白共同决定了染色质结构和开放程度，进而调控基因表达、转座子沉默、染色质互作以及性状遗传［29］。当转录调控区域的CpG岛发生甲基化修饰后，序列特异性甲基化结合蛋白（methyl cytosine binding protein,MeCP）与之结合，随后组蛋白去乙酰化复合物与MeCP 结合作用于组蛋白使其发生去乙酰化，接着染色体状态处于紧缩状态，阻碍了转录因子与顺式作用元件的结合，导致转录过程不能正常启动，进而时空性调控植物发育调控因子的表达，影响细胞的分化以至关键发育过程，最终可能导致植物性状的畸形［30］。

值得注意的是，研究表明部分非编码RNA可能调控DNA 甲基化修饰效应。microRNA（miRNA）、long non-coding RNA（lncRNA）、circular RNA（circRNA）等非编码RNA同样存在大量的内含子序列［31］，经过剪切能够形成特异二级结构，并以此行使生物学功能［32-33］。Song等［34］研究发现一类24 nt的miRNA能够调控毛白杨花发育通络相关基因的甲基化实现不同转录本的差异表达。有趣的是，针对野生型毛竹及其突变体厚竹两个样本组间鉴定到的DEmiRs，作者进行了靶基因预测以及功能富集分析，结果显示这些靶基因主要富集在DNA甲基化和蛋白磷酸化生物学过程。这一发现表明竹子miRNA可能调控相关靶基因的表达，通过甲基化修饰过程，进而调控竹子笋芽组织的分化和发育，为发掘厚竹自然变异形成机制提供了新的视角。植物中DNA甲基化研究仍然主要集中在蛋白编码区，而对占基因组近90%的非编码区域尚未系统开展，加之非编码区域是DNA甲基化修饰的富集区，开展非编码区域基因序列的DNA甲基化修饰研究有助于全面理解和解析基因的转录调控。

3 DNA甲基化是植物发育过程的关键因子

植物组织的分化和发育是基因在一定的时间和空间特异性表达的结果。而表观遗传修饰能从多个水平上调控基因的表达［17］；并且不同植物不同水平的调控之间相互关联，构成了一个复杂的表观遗传调控网络。DNA甲基化［35］，作为真核细胞普遍的一种重要的表观遗传修饰方式，它能够在不改变DNA序列的前提下调控基因的表达水平和模式，进而影响植物组织的生长和发育等重要生物过程［36］。在拟南芥中，仅有约5%的基因的启动子区存在甲基化，对于大多数基因来说DNA甲基化并不调控它们的转录，因此大多数DNA甲基化水平的增加或降低并不会导致严重的生长和发育缺陷。而作物和林木树种拥有更大的基因组，基因间区存在较密集的转座子，同时甲基化水平也较高。例如，Niu等［25］发现中国松基因组的巨大性主要来源于转座元件，而 DNA甲基化通过抑制转座元件进一步复制对基因组进行监管。不难看出，转座子或其他重复序列的甲基化扩散将使得启动子区的DNA甲基化更为普遍。因此，DNA甲基化在某些作物和林木中作用于基因表达的调控效应比在拟南芥中更加重要，往往导致严重的生长和发育缺陷甚至死亡。

Cubas等［37］以花型为两侧对称的野生型柳穿鱼和花型为辐射对称的突变体为研究材料，通过比较发现Lcyc基因启动子区在突变体中存在广泛甲基化，转录受到抑制；并且这种甲基化修饰是可遗传的，可与突变表型共分离。有趣的是，突变体在体细胞发育过程中偶尔会发生表型逆转，并且这与Lcyc的去甲基化和基因表达的恢复有关。这表明表观遗传突变可能在生物表型的遗传、发育和进化中发挥重要的作用。Ong-Abdullah等［38］发现在油棕体细胞克隆株系中，Karma转座子剪接位点周围区域若存在密集的甲基化位点则正常坐果，而低甲基化则预示同源转化、单性结实和产量骤降。

此外，DNA甲基化在植物生殖器官发育过程发挥重要作用。王子成等［39］发现菊花（Chrysanthemum morifolium）经5-azaC处理后植株的甲基化水平降低，开花时间提前，而其他表型性状未受影响。此外还发现在亚棉花药败育过程中，基因组DNA甲基化程度明显升高［40］。Walker等［41］发现一种独特的RNA定向DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation，RdDM）能够调控拟南芥雄性株系减数分裂细胞中的基因表达；而RdDM活性的缺失导致MPS1基因的错误剪接，从而破坏减数分裂。Manning等［42］发现当位于番茄Cnr（Colorless non-ripening）位点的Squamosa-promoter binding protein（SBP）-box基因的启动子区发生DNA超甲基化突变时，果肉无色，细胞间黏附性大幅下降，抑制了番茄果实的成熟。此外，Wang等［43］发现番茄果实成熟过程中DNA甲基化能够影响数百个多拷贝的转录因子基因的表达水平；并且对于某一多拷贝基因来说，其中一个基因拷贝总是明显高于或者低于其他拷贝的甲基化程度，作者推测DNA甲基化促进了果实成熟通路转录因子基因的趋异进化，并在番茄果实成熟等重要生物过程发挥调控作用。

可以看出，无论是对于有性还是无性繁殖后代来说，DNA甲基化修饰所引起的变异都存在广泛性和显著性。研究结果显示在植物无性繁殖过程中，DNA甲基化的增加或减少都有可能导致可遗传的表型改变［44］。对于大多数无性繁殖的植物多通过分离具有分生组织的萌蘖、根状茎、块茎以及珠芽等营养器官的方式进行，而在顶端分生组织［45］、根尖分生组织［46-47］以及花芽分生组织［48］等细胞中广泛存在着多种甲基化标记［17］。毛竹竹蔸、竹枝和竹秆上的芽能够发育成地下部分的竹鞭和地上部分的竹秆等，因此多通过分株、埋枝、移鞭等无性繁殖技术进行繁殖。一旦突变发生在某个分生组织细胞中，很容易产生大量携带突变的衍生细胞，进而影响或者彻底改变该组织的形态；或者在分生组织中某些生物过程被异常地激活，进而影响到与之关联的非分生组织细胞中某些基因的表达调控［26,49］。毛竹基因组大小约为2.0 Gb，其中60%为DNA重复序列［50-51］，转座元件种类丰富且功能多样［52-54］。不难看出，虽然毛竹主要进行无性繁殖，但是在长期的进化过程中DNA甲基化很可能通过调控基因表达、转座子沉默、染色质互作等影响了某些性状的遗传和变异。但是，目前基于DNA甲基化的毛竹自然突变体形成的分子机制研究尚没有报道。

4 DNA甲基化与基因组编辑技术

随着基因组编辑技术的快速发展，植物表观基因组的定向修饰研究取得了新成果。中国科学院遗传与发育生物学研究所曹晓风院士课题组在拟南芥中证实了DNA甲基化抑制胞嘧啶脱氨酶催化的C→T转换效率，并成功筛选获得了对甲基化胞嘧啶高效编辑的单碱基编辑器APOBEC3BCtd-nCas9，该蛋白能够有效编辑拟南芥和水稻中甲基化胞嘧啶，并可对编辑框内多个胞嘧啶实现单个C→T的精准编辑［55］。该团队的另一研究则基于SunTag-dCas9-TETcd系统，成功构建了一套针对水稻基因组DNA甲基化靶向删除的表观编辑体系，成功删除PRC2复合体关键成员OsFIE1基因和逆转座子Tos17位点DNA甲基化并实现二者异位表达，获得了一系列不同程度矮化的表观等位突变体，他们还发现OsFIE1的低甲基化水平和植株矮化表型能够稳定遗传并且不依赖外源转基因载体［56］。该研究首次在禾本科作物中建立了表观编辑体系，为竹类植物的遗传改良提供了新的工具和思路。

然而，目前竹子遗传转化体系尚不成熟，胚性愈伤组织诱导率低、遗传转化效率较低仍是竹子遗传改良研究面临的瓶颈问题，在竹类植物研究领域尚未见定点DNA 甲基化修饰研究的相关报道。因此，今后应致力于高效再生体系的建立，构建病毒基因载体［57］、纳米基因载体［58］等介导的遗传转化体系，同时联合经典遗传学和CRISPR/Cas9的方法，利用基因组编辑技术对植物基因组进行定点或者多位点的DNA甲基化修饰，这将为阐述具有DNA甲基化位点调控基因表达的分子机制奠定基础，对于植物组织分化发育过程表观转录调控功能的精确解析具有重要意义。

5 总结与展望

毛竹自然变异形成过程调控机制复杂，涉及生理生化指标、基因表达、转录调控以及DNA甲基化修饰等多层次、多因子的作用，这为系统阐述毛竹自然变异形成的分子调控机制提供了大量有价值的信息。但是过去的研究尚存在以下不足：（1）先前的研究主要集中在竹子材性品质形成，快速高生长和开花调控方面，而对自然突变体这一优异种质资源挖掘严重不足、基础研究滞后；（2）DNA甲基化已被证实在体细胞突变等自然变异过程发挥重要作用，但是，针对毛竹自然变异的DNA甲基化效应研究尚属空白；（3）现有研究主要集中于基因组DNA甲基化水平与基因表达量的相关性分析，而DNA甲基化影响基因转录的分子机制尚不明确；（4）重要的是，如何有效运用经典遗传学和CRISPR/dCas9体系探索DNA甲基化修饰对候选基因表达调控的分子机制一直是植物分子生物学研究领域的热点和难点。

竹子在保障木材安全、加速生态文明建设和助力乡村振兴等领域发挥重要作用，但基础研究相对薄弱；相对于其他竹种，毛竹的遗传背景和基因组信息比较丰富，是基础研究中非常有价值的研究材料。以毛竹及其突变体样本为材料，明确野生型及其突变体在形态、生理生化指标以及DNA甲基化模式方面的变异规律，并分析其相关性；解释DNA甲基化在组织分化和发育过程中的转录调控作用；利用基因组编辑技术，解析DNA甲基化在转录调控过程中的分子生物学功能。以上研究将为禾本科特别是竹类植物精准育种提供理论指导与技术支持。