从脑肠轴探讨黄芪建中汤对胃溃疡大鼠肝细胞生长因子及ERK1/2和TFF3蛋白表达的影响

陈思清,韩运宗,刘 琴,周 姝,周赛男

(1. 湖南中医药大学,湖南 长沙 410007;2. 湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410021)

胃溃疡是临床常见多发消化系统疾病,以黏膜组织缺损及炎症浸润为主要病理特点,常迁延难愈,易复发[1-2]。大量临床研究证实,中医辨证论治可促进胃溃疡的愈合,其中温健中焦、补益脾气是治疗脾胃虚寒型胃溃疡的主要治则,可扶助正气,防实证转虚。《消化性溃疡中医诊疗专家共识意见(2017)》[2]指出黄芪建中汤是治疗脾胃虚弱(寒)型胃溃疡的主方,且临床研究证实黄芪建中汤联合西药治疗能够促进此类溃疡的愈合[3-4],但其作用机制尚不明确。本实验基于脑肠轴,通过观察黄芪建中汤对胃溃疡胃组织中肝细胞生长因子(HGF)及下丘脑和海马区中磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)及肠三叶因子3(TFF3)蛋白表达的影响,探讨了其可能作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性成年大鼠60只,体重(200±10)g, 由湖南中医药大学动物实验中心提供,动物合格证号:SCXK(湘)2019-0004。饲养温度保持在(25±1)℃,湿度保持在(60±10)%,适应性饲养7 d。

1.2实验药物 黄芪建中汤由黄芪22 g、白芍18 g、桂枝9 g、生姜9 g、炙甘草6 g、擘大枣6枚、饴糖30 g组成,小承气汤由大黄12 g、枳实9 g、厚朴6 g组成, 药材均购于湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房,常规煎煮后去渣取滤液,加热浓缩至1 g/mL,冷却后4 ℃保存备用,灌胃剂量根据人和大鼠体表面积换算。奥美拉唑肠溶胶囊(常州四药制药有限公司,国药准字H20170228),用双蒸水配制成0.208 mg/mL的混悬液。

1.3主要试剂与仪器 摇床(其林贝尔公司),恒温箱(北京六一公司),微波炉(美的公司),切片刀(莱卡公司),光学显微镜(Motic公司),盖玻片、载玻片(海门远泰公司),HGF一抗(abcam公司),p-ERK1/2一抗(affinity公司),TFF3一抗(Proteintech公司),常规化学试剂(上海国药生物公司),精密PH计(雷磁公司),石蜡(上海国药生物公司),中性树胶苏木素PBS(7.2～7.6,Wellbio公司),枸橼酸盐缓冲液(Wellbio公司),伊红(Wellbio公司),二步法试剂盒(中杉金桥公司),DAB试剂盒(中杉金桥公司)。

1.4实验方法 按随机数字表法将大鼠分为4组各15只。正常组大鼠给予蒸馏水10 mL/(kg·d)隔日灌胃,每日不限饮食。模型组、奥美拉唑组和黄芪建中汤组大鼠参照文献[5]方法,给予小承气汤10 g/(kg·d)隔日灌胃结合饥饱失常法(灌胃当日不再进食其他食物,次日不限饮食)复制脾胃虚寒证模型,共计10 d;于第11天采用冰醋酸法建立胃溃疡模型,具体方法:采用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后将其固定于鼠板上,自左肋下纵向做2～3 cm切口剪开腹壁,将胃轻拉至腹外,在胃前壁浆膜面窦体相交处垂直放置直径6 mm的塑料管,管内注射100%冰醋酸,1 min后吸出,无菌棉花擦拭胃浆膜层后将其还纳于腹腔内,大网膜覆盖后,逐层缝合切口,伤口涂抹适量红霉素眼膏防感染。术后模型组大鼠继续隔日上午给予小承气汤并当日禁食,次日恢复饮食,共持续20 d;奥美拉唑组和黄芪建中汤组大鼠除同模型组的每日处理外,每日下午分别给予奥美拉唑4.2 mg/(kg·d)和黄芪建中汤6.8 g/(kg·d)灌胃,正常组隔日上午及每日下午给予10 mL/(kg·d)蒸馏水灌胃,均持续20 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1胃溃疡指数 处死大鼠后,迅速取下胃组织,采用放大镜(10倍)观察记录溃疡大小,并使用Guth标准进行评分,存在斑点或者糜烂记1分,糜烂长度<1 mm记1分、1～2 mm记2分、2～3 mm记3分、3～4 mm记4分,依次类推。糜烂宽度>2 mm时评分乘以2。全胃病灶分数总和为胃溃疡指数。由2人同时评估,取其平均值。

1.5.2胃组织病理形态 将大鼠胃组织置于4%多聚甲醛里浸泡固定,用手术刀对胃组织进行修整,将修切好的组织和对应的编号放到脱水盒子里;将装有胃组织的脱水盒放进脱水机专用吊篮里,于全自动脱水机内脱水;将脱水后的组织用包埋机包埋,先将融化的蜡注入包埋框,在蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出放入包埋框并贴上编号,于冷冻台进行冷却;待蜡凝固后将组织蜡块从包埋框取出并修整蜡块;修整好的蜡块置于冰箱内冷冻2 h后,取出置于石蜡切片机上切片,60 ℃烤片12 h后将切片置于二甲苯中15 min,3次;然后依次在100%,95%,85%,75%乙醇中每级放置5 min;再用蒸馏水浸洗5 min;苏木素染1 min,蒸馏水冲洗,PBS返蓝;伊红染0.5 min,蒸馏水冲洗;梯度酒精(95%～100%)脱水,每级5 min;取出后置于二甲苯10 min,2次;中性树胶封片后显微镜观察。

1.5.3胃组织中HGF蛋白与下丘脑及海马区p-ERK1/2、TFF3蛋白表达情况 分别取胃组织和脑组织常规脱水,石蜡包埋后切片,60 ℃烤片12 h;将切片置于二甲苯中20 min,3次。然后依次在100%,95%,85%,75%乙醇中每级放置5 min,再用蒸馏水浸洗5 min后进行热修复抗原,将切片浸入枸橼酸盐缓冲液,加热至沸腾后,冷却至室温,PBS洗涤3次;加入1%高碘酸,灭活内源性酶,PBS冲洗3次;分别滴加稀释的HGF一抗(1∶50)、p-ERK1/2一抗(1∶100)、TFF3一抗(1∶200),4 ℃过夜,PBS冲3次;滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗3次;滴加显色剂DAB工作液,室温孵育,蒸馏水洗涤;苏木素复染5～10 min,蒸馏水冲洗,PBS返蓝;各级酒精(60%～100%)脱水,每级5 min;取出后置于二甲苯10 min,2次;中性树胶封片后显微镜观察并测量平均光密度。

2 结 果

2.1各组大鼠胃溃疡指数比较 正常组无溃疡;模型组、奥美拉唑组、黄芪建中汤组胃溃疡指数分别为7.267±1.026,3.633±1.358,3.867±1.102,黄芪建中汤组和奥美拉唑组明显低于模型组(P均<0.05),黄芪建中汤组与奥美拉唑组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组大鼠胃组织HE 染色病理形态 正常组大鼠胃黏膜表面光滑无水肿,未见明显充血,未见溃疡点及糜烂斑等,各腺体、上皮细胞形态规整,位置连续有序;模型组大鼠胃黏膜上皮可见破损,皱襞存在中断,上皮组织有点状溃疡及糜烂,可见大量炎性细胞浸润;黄芪建中汤组与奥美拉唑组大鼠胃黏膜损伤较模型组轻,有轻度水肿和少量炎性细胞浸润,腺体排列大致规整,未见明显溃疡。见图1。

图1 正常组和脾胃虚寒型胃溃疡各组大鼠胃组织形态(HE染色,×400)

2.3各组大鼠胃组织中HGF及下丘脑和海马区中p-ERK1/2及TFF3蛋白阳性表达情况 免疫组化染色显示,正常组大鼠胃组织中有少量HGF蛋白表达,模型组大鼠胃黏膜组织中HGF蛋白表达明显增多,平均光密度明显高于正常组(P<0.05);正常组大鼠下丘脑及海马区有大量p-ERK1/2及TFF3蛋白表达,模型组大鼠下丘脑及海马区p-ERK1/2及TFF3蛋白表达较少,p-ERK1/2及TFF3蛋白阳性表达平均光密度均明显低于正常组(P均<0.05);黄芪建中汤组和奥美拉唑组大鼠胃组织中HGF蛋白与下丘脑及海马区p-ERK1/2及TFF3蛋白阳性表达平均光密度均明显高于模型组(P均<0.05),黄芪建中汤组与奥美拉唑组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2～4及表1。

表1 正常组和脾胃虚寒型胃溃疡各组大鼠胃组织中HGF与下丘脑及海马区p-ERK1/2、TFF3蛋白阳性表达平均光密度值比较

图2 正常组和脾胃虚寒型胃溃疡各组大鼠胃组织中HGF蛋白阳性表达情况(免疫组化染色,×400)

图3 正常组和脾胃虚寒型胃溃疡各组大鼠脑组织p-ERK1/2蛋白阳性表达情况(免疫组化染色,×400)

图4 正常组和脾胃虚寒型胃溃疡各组大鼠脑组织TFF3蛋白阳性表达情况(免疫组化染色,×400)

3 讨 论

现代医学认为胃溃疡的重要致病因素为胃黏膜的免疫机制受损,患者胃酸分泌多正常,甚则更低[6]。溃疡愈合是一个十分复杂的过程,与细胞移行、分化、增殖和细胞外基质形成等有关的细胞生长因子参与了这一过程,其中HGF与上皮细胞的生长有关,可促进毛细血管增生,稳定上皮细胞的功能形态[7-8]。有研究表明,糜烂性胃炎的发生发展和HGF/HGF受体(c-Met)通路有关[9]。c-Met可在肝细胞、胃上皮细胞等多种上皮细胞中表达,HGF与其结合后发挥促进损伤胃黏膜上皮细胞增殖及迁移的作用[5]。哈小琴等[10]研究发现,携带HGF基因真核表达质粒的减毒沙门菌可促进乙酸性胃溃疡大鼠创面组织再生修复,加快溃疡愈合。本实验结果显示,黄芪建中汤组和奥美拉唑组大鼠胃溃疡指数均明显低于模型组,胃黏膜损伤较轻,未见明显溃疡,胃组织中HGF阳性表达增多。证实黄芪建中汤可促进脾胃虚寒型胃溃疡创面的愈合,机制可能与其上调HGF表达相关。

早在《伤寒论》等中医著作中就已提到,胃肠系统疾病对神经系统有影响[11]。现代研究也发现“微生物群-脑-肠轴”与神经退行性疾病的发生发展密切相关[12]。因此推测胃溃疡或许与“脑肠轴”有关,会引起脑部某些相关蛋白表达的变化。ERKs是有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的一种蛋白激酶,且分布于细胞质内,其有2种亚型,分别是ERK1和ERK2。ERKs参与多种细胞效应,如信号传递、细胞形态维持、细胞增殖与分化、细胞凋亡等,在维持黏膜上皮的稳定性,促进黏膜上皮增殖修复中必不可少。ERK1/2作为细胞因子、激素等细胞外界信号,是导致细胞增殖与分化转导的通路集合[13]。本实验结果显示,黄芪建中汤组下丘脑及海马区p-ERK1/2蛋白表达明显上调,提示黄芪建中汤修复胃溃疡的机制可能与上调下丘脑及海马区p-ERK1/2蛋白表达,影响相关物质代谢有关。

TFF3属于神经肽家族之一,参与应激反应;且TFF3可通过调节PI3K/AU、RAS/Raf-ERK、NF-kB等信号通路广泛参与多种细胞效应,在胃肠道及脑中均有表达[14]。TFF3作为脑中具有多种功能的蛋白,主要参与生物的情绪、记忆、进食、神经-内分泌-免疫调节等[15]。有研究表明胃溃疡患者胃黏膜内TFF3表达增加,其与胃肠道黏蛋白的糖链相结合可产生具有稳定性的凝胶复合物以保持胃肠道黏膜组织的稳定[16]。本实验结果显示,黄芪建中汤组大鼠下丘脑及海马区TFF3蛋白表达明显上调,提示黄芪建中汤可能通过上调TFF3蛋白表达,影响神经-内分泌-免疫调节功能而促进溃疡愈合。

综上所述,黄芪建中汤可促进脾胃虚寒型胃溃疡大鼠溃疡愈合,其机制可能与上调胃组织中HGF和下丘脑及海马区p-ERK1/2、TFF3蛋白表达,以胃肠轴为基础进一步调控神经-内分泌-免疫调节系统相关。至于HGF、p-ERK1/2及TFF3在致病过程中发挥作用的确切机制尚有待于进一步探讨。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。