当归挥发油对血管紧张素Ⅱ所致肥大心肌细胞CaN信号通路和T型钙通道的影响

王雨薇,刘 凯,孙少伯,李应东

(1. 甘肃省人民医院,甘肃 兰州 730030;2. 甘肃中医药大学中西医结合研究所,甘肃 兰州 730000)

心肌肥厚是心肌细胞和间质细胞对神经体液因素或机械牵张所作出的应答反应,血管紧张素Ⅱ作为 肾素-血管紧张素-醛固酮(RASS)系统中的主要物质,在高血压左心室肥厚的形成中扮演了重要的角色[1-3]。根据前期研究可知,血管紧张素Ⅱ所致的心肌细胞肥大,首先是通过血管紧张素肽Ⅱ受体(ATR)激活Ca2+通道,Na+-Ca2+交换体和肌浆网释放Ca2+,升高的Ca2+可活化Ca2+/钙调素(CaM)依赖的钙调神经磷酸酶(CaN),使细胞质中的NF-AT3去磷酸化进入细胞核,诱导c-fos、c-jun等原癌基因的表达,使心肌细胞蛋白合成增加发生细胞肥大,故细胞内Ca2+的超载是心肌细胞发生肥大的重要环节[1-3]。有研究显示,在心肌细胞发生肥大的过程中,T型Ca2+通道的表达是增加的[4],T 型钙通道家族包括3个不同的α1亚基基因,其中CACNA1G、CACNA1H分别编码α1G、α1H亚基,从而构成了Cav3.1和Cav3.2两种T型钙通道亚型[5]。中医认为,心肌肥厚发生的病机关键是肝肾阴虚、瘀血互结、心络痹阻。当归为“血中气药”,不仅补血,还能行血活血,有利于治疗“血瘀”所致的疾病,当归挥发油是从当归中提取的有效成分。本研究从细胞、分子水平上探讨了当归挥发油是否具有拮抗血管紧张素Ⅱ所致心肌细胞肥大的作用,为进一步探讨心肌细胞肥大的可能机制及寻找有效治疗药物提供依据。

1 实验材料和方法

1.1细胞与中药材 H9c2心肌细胞株由中国科学院上海细胞库提供。当归购自甘肃省岷县药材站,经甘肃中医药大学中药鉴定教研室鉴定为当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的根。

1.2实验试剂 胎牛血清(Fetal Calf Serum,FCS)和DMEM/F-12(1∶1)(DF-12,高糖)购自海克隆生物化学制品(北京)有限公司,成比例加入15%的胎牛血清制成完全培养基,4 ℃保存。罗丹明123染液购自美国Sigma公司,先用乙醇溶解为5 g/L,保存于-20 ℃,用前溶于完全培养液中,调整终浓度为10 mg/L。Fluo-3/AM(钙离子荧光探针)购自碧云天公司,用1.77 mL的DMSO溶解500 μg的Fluo3/AM配成0.25 mmol/L储存液,使用时用培养液稀释50倍使终浓度为5 μmol/L。兔抗Cav3.1和Cav3.2多克隆抗体、鼠抗β-actin购自SaniaC公司。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。Marker (50bpDNAladder)购自上海生物工程有限公司。

1.3实验仪器 二氧化碳培养箱(BB16UV型), 德国Heraeus公司;超净工作台(VS-1300L型), 苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司;6890GC气相色谱/ 5973I MSD 质谱联用仪,美国安捷伦公司;高激光共聚焦显微镜FV1000,日本Olympus公司;台式高速离心机(PLCO型), 德国Heraeus公司;小型Trans-Blot转印槽和PowerPacUniversal型电泳仪,美国Bio-Rad公司。

1.4细胞分组及培养方法 心肌细胞培养72 h后随机分为5组:正常组换无血清培养液继续培养;血管紧张素Ⅱ组加入终浓度为10-4mg/L的血管紧张素Ⅱ培养;当归挥发油低、中、高剂量组均先加入终浓度为10-4mg/L的血管紧张素Ⅱ孵育2 h,然后分别加入终浓度为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的当归挥发油培养;各组在37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养24 h后终止实验。

1.5检测指标及方法

1.5.1心肌细胞生长抑制效应 96孔板培养心肌细胞贴壁,造模,37 ℃、5%CO2箱中继续培养24 h后,加10 μL/孔MTT(5 mg/L)培养4 h后,加150 μL/孔DMSO,待孔内颗粒完全溶解后,测定各孔在490 nm处的吸光度值。测定标本蓝紫色颗粒溶解后的OD值,可定量反映活细胞数量。

1.5.2心肌细胞内Ca2+浓度 取状态良好的心肌细胞,接种于共聚焦显微镜专用培养皿中(密度1.5×105/mL)培养过夜;按照“1.4”方法分组培养24 h后,用PBS洗涤3次×5 min;放入5 μmol/ L的fluo-3/AM溶液100 μL,37 ℃避光负载40 min;40 min后PBS漂洗2～3次,加入1 mL PBS上机检测;488 nm的氩离子激光激发,发射波长530 nm,激光共聚焦显微镜扫描拍照。用ImageJ图像处理软件分析细胞内荧光强度。

1.5.3心肌细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白表达情况 取处于对数生长期的心肌细胞,弃去旧培养基,严格按照“1.4”方法分组培养24 h后用PBS液漂洗心肌细胞;加单去污剂裂解液提取细胞蛋白质(冰上操作),用考马斯亮蓝法测定所得蛋白浓度;取20 μL蛋白,通过SDS液PAGE电泳后将蛋白转至PVDF膜上;5%脱脂奶粉封闭1 h,TBST漂洗3次×5 min;分别加入10 μL CaN、Cav3.1、Cav3.2抗体,37 ℃孵育20 min,4 ℃过夜,次日,37 ℃继续孵育20 min;用TBST漂洗4×5 min;以β-actin作为内参,加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG,37 ℃孵育1 h;用TBST漂洗3×15 min;加ECL发光试剂孵育15 min;进入暗室将膜通过感光胶片曝光30 min,然后用显影液和定影液洗像。用Alpha Imager 2200图像分析系统对胶片进行灰度扫描,分别计算CaN、Cav3.1、Cav3.2与β-actin灰度比值代表其相对表达量。

2 结 果

2.1各组心肌细胞生长抑制效应 正常组、血管紧张素Ⅱ组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组心肌细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(103.68±1.74)%、(99.38±1.93)%、(100.49±0.92)%、(100.69±1.31)%,血管紧张素Ⅱ组心肌细胞存活率明显高于正常组(P<0.05),当归挥发油各组心肌细胞存活率均明显低于血管紧张素Ⅱ组(P均<0.05),当归挥发油各组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2各组心肌细胞内Ca2+表达荧光强度 正常组、血管紧张素Ⅱ组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组心肌细胞内Ca2+荧光强度分别为90.49±8.16,187.17±12.07,166.88±13.19,171.22±14.08,135.41±10.61,血管紧张素Ⅱ组心肌细胞内Ca2+荧光强度明显高于正常组(P<0.05),当归挥发油各组心肌细胞内Ca2+荧光强度均明显低于血管紧张素Ⅱ组(P均<0.05),当归挥发油各组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.3各组心肌细胞内CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白表达情况 血管紧张素Ⅱ组心肌细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05),当归挥发油高、中剂量组细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白相对表达量和当归挥发油低剂量组细胞中CaN、Cav3.1蛋白相对表达量均明显低于血管紧张素Ⅱ组(P均<0.05)。当归挥发油各组间CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及表1。

图1 正常组和各组肥大心肌细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白表达情况

表1 正常组和各组肥大心肌细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

血管紧张素Ⅱ所致的心肌细胞肥大是通过作用于AT1受体介导的,其具有生长因子样作用,与AT1受体结合后,一方面可激活磷酸脂酶C(PLC),产生二磷酸肌醇磷脂(PIP2),使后者分解的主要产物三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)增加,IP3可激活肌浆网的Ca2+贮存库释放Ca2+至胞浆,使胞内Ca2+浓度升高,Ca2+又与DG结合激活蛋白激酶C(PKC)[6-8]。Ca2+是细胞内一种重要的第二信使,其可通过影响下游的信号转导途径参与机体的生理功能调节。另外细胞内Ca2+增加和PKC激活均可激活细胞早期反应原癌基因,进一步调控靶基因的表达,加速蛋白质生成,造成心肌细胞肥大。研究发现血管紧张素Ⅱ所致心肌细胞肥大动作电位延长,Ca2+内流从而使细胞内Ca2+增加,细胞内Ca2+的增多可激活CaN,从而启动核内的CaN信号通路,使促心肌细胞肥大基因表达,导致心肌肥大[9-11]。

中医认为“气为血之帅,血为气之母”[12],气血二者的相互作用和动态平衡正好可以用现代医学的“血压”来概括,异常的血压往往是“气血失和”这种病理变化发生时的表现[13-15]。而“风眩并心胀”的病位在血脉与心,是为痰饮、脂浊、瘀血互结、血脉瘀阻[16]。当归挥发油为“血中气药”,轻而能行,通过“行血”解除“血瘀”。本实验选用10-4mg/L血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大,显示血管紧张素Ⅱ组心肌细胞存活率、心肌细胞内Ca2+浓度和心肌细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白相对表达量均较正常组高;当归挥发油各组心肌细胞存活率、心肌细胞内Ca2+荧光强度和当归挥发油高、中剂量组细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白相对表达量均较血管紧张素Ⅱ组低。提示当归挥发油可拮抗血管紧张素Ⅱ引起的Ca2+超载,下调肥大心肌细胞中CaN、Cav3.1、Cav3.2蛋白表达,从而抑制心肌细胞肥大,且高剂量作用更明显。本实验证实当归挥发油通过钙阻滞作用抑制了心肌细胞肥大的发展,而钙阻滞作用在人体内可以使血管平滑肌松弛,解除小动脉痉挛,产生血液流变学影响,降低前负荷和全血黏度,从而抑制高血压左心室肥厚的发生发展,这为日后临床中治疗高血压左心室肥厚提供了一定实验依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。