基于GRP78/Caspase-12/CHOP信号通路探讨艾灸预防急性胃黏膜损伤的机制

韦 芳,霍新慧,周知然,兰永利,阿力米热·阿布都热西提

(1. 新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2. 新疆维吾尔自治区中医医院,新疆 乌鲁木齐 830099)

急性胃黏膜损伤是指在内外部不良刺激的作用下,如某些药物、某些严重感染、严重外伤、颅内病变、大手术、休克等危急情况下,导致机体胃黏膜损伤,出现胃黏膜糜烂、溃疡甚至出血的急性应激性病变。随着“治未病”逐渐成为研究热点,艾灸在该领域中占据着非常重要的作用[1]。课题组前期研究已证实,艾灸足三里穴、中脘穴可以加强胃黏膜微循环屏障,抵抗胃黏膜损伤,且艾灸的作用明显强于针刺作用[2],但作用机制仍有待明确。目前研究认为各种应激状态均可导致内质网应激[3],内质网应激是炎症的特征之一,而炎症参与急性胃黏膜损伤的发生发展。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)作为内质网应激的标志性蛋白,是内质网跨膜蛋白的受体分子伴侣[4],在内质网应激时,GRP78表达上调,从而发挥保护细胞的作用。CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)是C/EBP转录因子家族中的一种重要蛋白,其在C/EBP基因中的作用是诱导细胞凋亡,所以CHOP蛋白的表达情况在一定程度上也能够反映内质网应激介导的细胞凋亡的程度[5]。研究表明,半胱氨酸蛋白水解酶-12(Caspase-12)基因表达水平在ERS诱发的细胞凋亡过程中起着重要作用,也是内质网应激诱导细胞凋亡的另一种信号转导途径[6-7]。因此,本实验通过建立急性胃黏膜损伤动物模型,从GRP78/Caspase-12/CHOP信号通路探讨了艾灸预防急性胃黏膜损伤的机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康清洁级大鼠52只,雌雄各半,体重(180±20)g,由新疆医科大学动物实验中心提供,实验动物使用许可证编号:SYXK(新)2018-0003。常规饲养,使大鼠适应饲养环境,实验室环境温度(22±2)℃,相对湿度55%～60%,光照12 h/d,自由饮食水。实验过程中对动物处置方式符合《关于善待实验动物的指导性意见》以及相关动物伦理学要求。

1.2实验试剂及仪器 无水乙醇(天津致远化学试剂有限公司);阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司,规格:100 mg×30片/盒);一次性针灸针(华佗牌,规格:0.25 mm×13 mm);特制香烟型纯艾条(南阳汉医艾绒有限责任公司,规格:4 mm×120 mm);悬灸支架(知福堂,蕲春上工记艾灸器具开发有限公司);大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10) ELISA检测试剂盒(上海优选生物科技有限公司);DAB(北京中杉金桥,批号:2040A1012);酶标分析仪(上海生物科技有限公司,Infinite F50);显微镜(日本奥林巴斯,型号:BX51T-PHD-J11);切片机(德国徕卡,型号:RM2016)。

1.3实验方法 52只大鼠适应性饲养7 d后,随机分为正常组、模型组、艾灸预处理组、针刺预处理组,每组13只。正常组和模型组大鼠常规饲养,每天固定时间将大鼠自然固定于鼠板上20 min,1次/d,共7 d。艾灸预处理组:将大鼠仰卧位固定于鼠板上,参照《实验针灸学》[8]中常用动物(大鼠)穴位定位法选取足三里穴(双侧)、中脘穴,然后用弯剪剪去施灸点局部毛发,用记号笔标记穴位,将隔热贴打孔(孔径为0.5 cm),贴于选取的穴位及对照点之上,艾条点燃后放置于艾灸架上,正对施灸部位,保持距离2 cm左右,3个穴位同时开始施灸,施灸部位的温度控制在42 ℃左右,每次艾灸持续20 min,1次/d(早上9:00开始),处理完后回笼正常饲养,共7 d。针刺预处理组:大鼠固定方式、所选穴位、干预时间与艾灸预处理组相同,针刺方法为指切进针法,操作者左手示指按压所刺腧穴位置旁边部位,用右手持针,紧靠左手指甲面快速进针,间隔5 min进行提插捻转,每次均由同一人对大鼠进行操作,处理完后回笼常规饲养。第8天,4组大鼠不给予任何干预处理,24 h禁食不禁水。第9天开始,参照课题组前期实验对模型组、艾灸预处理组、针刺预处理组大鼠进行无水乙醇联合阿司匹林混悬液灌胃制备急性胃黏膜损伤模型[9]:按0.6 mL/100 g 的剂量用灌胃针头将无水乙醇注入大鼠胃内,1 h后再将200 mg/kg阿司匹林混悬液0.1 mL/100 g注入大鼠胃内,连续造模7 d。

1.4取材方法 第15天造模结束后,各组大鼠禁食24 h,禁水8 h。第17 天用10%水合氯醛0.3 mL/100 g注入腹腔麻醉,约10 min待大鼠处于全麻状态后,剖开腹部,暴露腹腔,取腹主动脉血,标本在常温下静置,待其血清析出,使用离心机取上清液;然后将大鼠全胃取出,用冰生理盐水冲洗,肉眼观察胃黏膜损伤情况。

1.5检测指标及方法

1.5.1一般情况 每日定时观察大鼠毛发颜色光泽、饮食水量、二便、精神状态及活动情况,每隔2 d测量1次大鼠体重。

1.5.2胃组织病理形态 取一小块(约1.0 cm×0.5 cm)严重受损的胃黏膜组织,用4%多聚甲醛将标本固定、脱水、石蜡包埋、切片,用苏木素-伊红染色(HE)后光镜下进行组织病理形态学观察。

1.5.3血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平将取出的大鼠腹主动脉血液标本常温静置10～15 min,然后在4 ℃下3 000 r/min离心约20 min后提取上清液置于EP管中,存放于-80 ℃冰箱里待检。严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平。

1.5.4胃组织中GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白表达情况 采用免疫组化法检测:取常规石蜡包埋组织切片,经抗原修复后,滴加正常山羊血清液室温封闭,滴加一抗工作液在组织上,4 ℃过夜,PBS洗涤3次后,滴加生物素化第二抗体、辣根酶标记链霉卵白素工作液,DAB显色、复染、常规树脂封片,镜下观察。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 在造模前、艾灸预处理及针刺预处理期间,4组大鼠毛发光泽,饮食水量、二便、精神等一般状态均正常,体重增加。在造模后,与正常组大鼠比较,模型组大鼠毛发无光泽,饮食水量减少,大便稀溏,精神不振,蜷缩懒动,状态差,体重下降;艾灸预处理组、针刺预处理组大鼠毛发、饮食水量、大便情况、精神状态均好于模型组,体重无明显变化。

2.2各组大鼠胃组织病理形态学 光镜下,正常组大鼠胃黏膜表面上皮结构清晰完好,细胞排列整齐有序,未发现充血、红染、脱落等炎性细胞浸润现象。模型组大鼠胃黏膜上皮细胞结构破坏,结构不完整,细胞分布错乱无序,细胞内可见明显的充血、红染,有炎症细胞浸润,胃黏膜组织损伤明显。艾灸预处理组和针刺预处理组大鼠胃黏膜结构比较清晰,细胞部分有脱落,细胞内充血、红染情况较模型组轻,炎症细胞浸润较少。见图1。

2.3各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比较 与正常组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显升高(P均<0.05),血清IL-10水平明显降低(P<0.05)。艾灸预处理组和针刺预处理组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显低于模型组(P均<0.05),血清IL-10水平均明显高于模型组(P均<0.05);与针刺预处理组比较,艾灸预处理组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均更低(P均<0.05),血清IL-10水平更高(P<0.05)。见表1。

表1 正常组和急性胃黏膜损伤各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比较

2.4各组大鼠胃组织中GRP78、Caspase-12、CHOP阳性表达情况 与正常组比较,模型组大鼠胃组织中GRP78、Caspase-12、CHOP呈强阳性表达,细胞内充满大量棕黄色颗粒;与模型组比较,艾灸预处理组和针灸预处理组大鼠胃组织中GRP78、Caspase-12、CHOP呈弱阳性表达,细胞内棕黄色颗粒减少,艾灸预处理组减少更明显。 见图2～4。

图2 正常组和急性胃黏膜损伤各组大鼠胃组织中GRP78阳性表达情况(免疫组化染色,×200)

图3 正常组和急性胃黏膜损伤各组大鼠胃组织中Caspase-12阳性表达情况(免疫组化染色,×200)

3 讨 论

急性胃黏膜损伤是临床常见的急症,损伤后会激活机体自身修复功能,表现为上皮细胞增生,而多种保护因子参与了胃黏膜的细胞增殖修复的过程,从而提高胃黏膜的保护及防御功能,促进胃黏膜修复,避免损伤向深层发展,如IL-10为目前公认的抗炎和免疫抑制因子,参与了炎性反应和免疫反应[10-11]。但在应激状态下,胃黏膜细胞糜烂充血导致表面上皮细胞再修复能力下降,促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β表达增加,削弱了黏膜自身的防御修复作用[12]。而溃疡难以愈合和容易复发的主要原因是在胃黏膜受损的过程中,一直存在着炎症反应[13],炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β经常被用作炎症反应的重要标志物来评价急性胃黏膜损伤的炎症反应程度[14]。另外急性胃黏膜损伤在应激状态下导致内质网应激,使GRP78、Caspase-12、CHOP阳性细胞增加,启动细胞凋亡通路,加剧黏膜损伤。

图4 正常组和急性胃黏膜损伤各组大鼠胃组织中CHOP阳性表达情况(免疫组化染色,×200)

艾灸是中医最独特的一种外治疗法,通过艾灸对某些腧穴进行温热刺激, 可以激发人体经脉之气,提高身体抵抗力和应变能力,促进炎症的消除和组织的恢复,从而达到预防和治疗的目的,减少疾病的伤害[15]。相对于针刺疗法,由于艾灸操作安全简便等特点,被广泛地用于预防和保健,其具有针药无法达到的功效。大量实验研究结果表明,艾灸能启动抗炎、抑制凋亡、促修复等一系列抗胃黏膜损伤效应[16-18],这为艾灸防治急性胃黏膜损伤提供了理论基础。

胃黏膜损伤性疾病可归属于中医“胃脘痛”范畴。足阳明胃经与胃腑疾病有着密切的关系。足三里穴为足阳明胃经的合穴,胃之下合穴,具有益气养血、调节胃肠功能和提高免疫力的作用,是治疗胃脘部疾病的首选穴。向娟等[19]报道艾灸足三里穴可促进表皮生长因子(EGF)和抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达,抑制凋亡蛋白(Bax)表达,保护胃黏膜。中脘穴位于任脉上,在心蔽骨与脐连线的正中,是足阳明胃经的募穴,特定穴中八会穴的腑会,也是手太阳经、少阳经、足阳明经、任脉之会。中脘穴正位于胃的中部,具有疏肝养胃、和胃降逆、健脾利湿之效,主治一切腑病,尤胃腑优先。足三里穴与中脘穴配伍属于“合募配穴”,合用擅长治疗胃病,专门调理胃腑[20-21]。殷茵等[22]报道,电针足三里、中脘可调节小鼠胃运动。汪婧修等[23]研究证实,足三里穴与中脘穴配伍能够促进应激性胃溃疡大鼠胃黏膜损伤修复,机制可能与调节丝裂原活化蛋白激酶(MEK)/胞外信号调节激酶(ERK)信号通路相关。故本实验选取足三里、中脘穴进行艾灸及针刺。

本实验结果显示,模型组大鼠造模后胃黏膜组织损伤明显,炎症细胞浸润,血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高而IL-10水平降低,胃组织中GRP78、Caspase-12、CHOP呈强阳性表达;艾灸预处理组和针刺预处理组大鼠胃黏膜组织损伤明显较轻,炎症细胞浸润较少,血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平较低而IL-10水平较高,胃组织中GRP78、Caspase-12、CHOP呈弱阳性表达,且艾灸预处理组上述效应更明显。提示艾灸预处理和针刺预处理均可明显减轻大鼠急性胃黏膜损伤,而艾灸预处理干预效果更明显,这可能与艾灸能基于GRP78、Caspase-12、CHOP信号通路抑制内质网应激,调节促炎和抑炎因子水平,减轻炎性反应有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。